李利紅，陳忠杰，盧婷婷，解克偉

（1．鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W校藥物工程系，河南 鄭州450011；2．禹州森源本草天然產物有限公司，河南 禹州461683）

致病性大腸桿菌病是現(xiàn)代規(guī)?；?、集約化畜禽養(yǎng)殖的主要傳染病之一，目前尚無理想的疫苗來預防，臨床主要采用抗菌藥物治療。近年來，由于抗菌藥物的持續(xù)和不恰當?shù)厥褂茫竽c桿菌耐藥機制不斷變遷，耐藥性不斷提高［1－3］，導致抗菌藥物的療效降低甚至失去療效；大腸桿菌耐藥現(xiàn)象已經成為現(xiàn)代畜牧業(yè)健康養(yǎng)殖的限制性瓶頸，而抗菌藥物不規(guī)范使用所帶來的的環(huán)境衛(wèi)生和食品安全問題也已越來越受世人關注，因此如何選用對大腸桿菌有較好抑制作用的藥物是當今獸醫(yī)臨床的主要任務之一。中草藥具有來源廣、副作用小、不易產生耐藥性等特點，已經成為現(xiàn)代預防和控制細菌性感染疾病方面的重要研究對象［4－5］。近年來關于中藥芳香性物質的抗微生物活性報道很多［6－8］，但是關于其對大腸桿菌抑制效果的研究報道不多，因此，本試驗選取丁香、八角茴香和迷迭香3種香料植物，提取其中的5種主要成分，在體外研究其對大腸桿菌的抑制作用，期望為獸醫(yī)臨床合理使用中草藥提取物防治大腸桿菌病提供理論和試驗依據(jù)，為研究和開發(fā)抗菌中藥解決耐藥菌株的產生和抗生素短缺問題提供途徑。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

1．1．1 試驗材料 迷迭香采自河南禹州森源本草天然產物有限公司種植基地，其他藥材購自鄭州零售藥店。

所用菌株分別為：大腸桿菌（標準型）；大腸桿菌（臨床致病型，從犢牛稀糞便中分離）。菌株由鄭州牧業(yè)工程專科學校藥物工程系實驗室提供。

1．1．2 主要儀器與試劑 CTXNW－2B循環(huán)超聲萃取儀（北京弘祥隆生物技術開發(fā)有限公司）；R－1001－VN旋轉蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿有限公司）；RE－5210旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮）；LXJ－IIB離心機（上海安亭科學儀器廠）；P230II高效液相色譜儀（上海依利特）；BT125D十萬分之一分析天平（賽多利斯），阿貝折射儀（上海宇隆2W）。

鼠尾草酸和迷迭香酸標準品，均由禹州森源本草天然產物有限公司提供；重蒸水，甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

1．2 方法

1．2．1 精油的提取制備 稱取丁香、八角茴香和迷迭香藥材各500g，用水蒸氣蒸餾法提取各自的揮發(fā)油，20℃以下測定相對密度和折光率。

1．2．2 迷迭香酸和鼠尾草酸的提取制備 稱取提取過精油的迷迭香殘渣200g，用40倍體積的90%乙醇進行回流提取1h（加少許檸檬酸），將提取液進行過濾，濾液和殘渣分別用來提取鼠尾草酸和迷迭香酸。濾液進行減壓濃縮至1／5體積，4 000r／min離心，保留沉淀物，進行真空干燥，稱重，用HPLC測定鼠尾草酸含量。殘渣加50倍體積的水進行超聲提取30min，過濾，對濾液進行減壓濃縮和真空干燥，稱重，用HPLC測定迷迭香酸含量。

1．2．3 迷迭香酸和鼠尾草酸含量的測定 （1）鼠尾草酸標準品溶液的配制：精密稱取105℃干燥4h后至質量恒定的鼠尾草酸標準品10．0mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇溶解并稀釋至刻度定容，搖勻，其質量濃度為1mg／mL作為標準溶液；（2）迷迭香酸標準品溶液的配制：精密稱取80℃下干燥至恒重的迷迭香酸標準品10．0mg溶于10mL甲醇溶解并稀釋至刻度定容，得1mg／mL迷迭香酸標準溶液；（3）鼠尾草酸樣品測定：稱取鼠尾草酸提取物100mg，無水乙醇定溶至50mL，微孔濾膜過濾，超聲脫氣，HPLC測定。采用C18柱，流動相為乙腈：0．1%磷酸＝60∶40，流速為1mL／min，230 nm測定；（4）迷迭香酸樣品測定：稱取迷迭香酸提取物100mg，甲醇定溶至50mL，微孔濾膜過濾，超聲脫氣，HPLC測定。采用C18柱，流動相為甲醇∶0．05%磷酸＝45∶50，流速為0．6mL／min，283nm測定。均做平行試驗3次，以峰面積按外標法進行定量計算。

1．2．4 菌種的復壯與擴增 參照文獻［9］進行大腸桿菌的復壯和擴增，用于營養(yǎng)瓊脂平板涂菌。

1．2．5 涂菌 取制備好的營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基，分別加入100μL制備好的105CFU／mL菌液，用涂菌玻璃棒涂均勻。

1．2．6 打孔 用直徑為6．5mm的打孔器在涂菌的瓊脂培養(yǎng)基上均勻打孔，并編號，每種藥重復兩個平皿，每個平皿做3個孔。孔徑大小、深度保持均勻一致。打好孔后在酒精燈火焰上略微加熱，使局部培養(yǎng)基熔化重新凝固與平皿底部結合，防止加入的藥物從底部的縫隙流出。

1．2．7 加藥 將迷迭香酸和鼠尾草酸配制成含有效成分1mg／mL的水溶液，揮發(fā)油直接添加，分別加入各孔中，每孔加20μL藥液，置于恒溫箱中37℃條件下，培養(yǎng)24h。取出，量取抑菌圈直徑。每孔在不同方向測量2次，取平均值。

1．2．8 抑菌結果判定 抑菌效果判定，抑菌直徑＞20mm為極敏感，用“＋＋＋＋”表示；15～19mm為高敏感，用“＋＋＋”表示；10～14為中敏感，用“＋＋”表示；10mm以下為低敏感，用“＋”表示；“－－”表示無抑菌作用。

2 結果與分析

2．1 提取結果 迷迭香經蒸餾、脫水后得到無色透明迷迭香油，提取率為1．5%（平均每100g原料得到1．5mL 精油），相對密度為0．869，折光率為1．466。丁香花蕾經蒸餾、脫水后得到無色透明丁香油，提取率為9．5%（平均每100g原料得到9．5mL精油），相對密度為1．041，折光率為1．532。八角茴香經蒸餾、脫水后得到無色透明八角茴香油，提取率為5．3%（平均每100g原料得到5．3mL精油），相對密度為0．982，折光率為1．555。鼠尾草酸的提取率為7%；迷迭香酸的提取率為4%。

2．2 迷迭香酸和鼠尾草酸含量測定結果 230nm下，經HPLC測定，鼠尾草酸的純度為16．24%；迷迭香酸的純度為5．37%。

2．3 藥物敏感性測定結果 幾種提取物的抑菌圈測定結果見表1所示。

表1 抑菌圈測定

由表1可見，鼠尾草酸和迷迭香酸都對致病性大腸桿菌表現(xiàn)高度敏感，對標準型大腸桿菌表現(xiàn)中度敏感；迷迭香油和丁香油對標準型大腸桿菌的抑制作用均明顯大于對致病性大腸桿菌的抑制作用；八角茴香油對兩種大腸桿菌的抑制作用相差不明顯。幾種提取物對標準型大腸桿菌的抑菌效果依次為：丁香油＞鼠尾草酸＞迷迭香油＞迷迭香酸＞八角茴香油，最大抑菌圈達20mm；對臨床型大腸桿菌的抑菌效果依次為：鼠尾草酸＞迷迭香酸＞八角茴香油＞迷迭香油＞丁香油，最大抑菌圈達19 mm。

3 討論

3．1 本試驗用現(xiàn)代中藥提取、分析技術，對幾種中藥提取物抑制大腸桿菌的作用進行了體外試驗，具有工藝穩(wěn)定、有效成分含量明確、質量可控的特點；本試驗表明，迷迭香酸、鼠尾草酸、迷迭香油、丁香油和八角茴香油均有較強的體外抑制大腸桿菌作用。

3．2 由于中藥成分復雜，抗感染療效主要以增加機體免疫力為途徑，因此目前中藥抑菌作用的研究方面還存在試驗操作缺乏統(tǒng)一標準、體內體外試驗結果不一致和作用機制探討不深等問題［10－12］。今后應進一步借助現(xiàn)代先進的工藝和分析方法，加強對中藥抗感染藥物的正確認識，深入探討中藥作為抗感染治療和消除細菌耐藥性的作用途徑和作用效果。

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