陳 霞，汪 洋，駱鵬杰，李 娟，吳聰明

（1．中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所 傳染病預防控制國家重點實驗室 感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 昌平102206；2．中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 海淀100193；3．國家食品安全風險評估中心，北京 朝陽100022）

空腸彎曲菌（下稱空彎）是一種重要的食源性致病菌，是動物體內(nèi)的正常菌群［1－2］，可造成人類腸炎的暴發(fā)流行和食物中毒［3］。我國對于食品源動物空彎的研究尚在起步，但隨著國際貿(mào)易的繁榮和我國對食品安全的日益重視，食品動物源空彎病的流行分布和耐藥性研究愈來愈受到廣泛的重視。喹諾酮類藥物由于其高效、廣譜的抗菌特點，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)曾長期、廣泛地使用，不少研究也報道了不同細菌對于其日趨嚴重的耐藥情況。

我國食品動物源空彎喹諾酮耐藥性的研究較少［4］。本文通過對采集自2008年山東省的雞源空彎進行喹諾酮類耐藥機制的闡述，為我國動物源性空彎耐藥性現(xiàn)狀的了解和評估提供可靠的數(shù)據(jù)，對獸醫(yī)及人醫(yī)領域有著十分重要的公共衛(wèi)生意義。

1 材料與方法

1．1 菌株背景 202株空彎采集于2008年山東省五地的大型綜合肉雞屠宰場，其背景信息已有文章詳述［4］，歸納如下：202株空彎分離株對受試的喹諾酮類藥物均呈現(xiàn)非常高的耐藥率和耐藥水平，超過98%的菌株對喹諾酮耐藥。

1．2 主要試劑 普通PCR用2×TaqPCR MasterMix，購自天根生化科技（北京）有限公司；測序PCR用PremixExTaq＠version 2．0，購自 TaKa－Ra寶生物工程（大連）有限公司。

1．3 可移動喹諾酮耐藥基因的篩查 按照已有文獻對常見的7種可移動喹諾酮耐藥基因進行篩查［5］。

1．4gyrA和gyrB基因相關區(qū)域研究及parC的測定 采用錯配擴增PCR（MAMA PCR）對所有空彎的gyrAQRDR 的 C－257－T 突變進行檢測［6］，利用普通PCR對parC基因進行測定［7］。

挑選環(huán)丙沙星（喹諾酮類代表藥物）不同耐藥水平空彎進行gyrA和gyrB相關區(qū)域測序，使用引物如文獻所述［8－9］。

2 結果

2．1 可移動喹諾酮耐藥基因的篩查情況 通過對202株空彎進行7種常見的喹諾酮耐藥基因篩查，未發(fā)現(xiàn)在受試空彎中存在任何可移動的喹諾酮耐藥基因。

2．2 QRDR的突變測定及對parC基因的測定結果 對202株空彎進行gyrAQRDR特異性點突變C－257－T的檢測，發(fā)現(xiàn)除龍口地區(qū)一株環(huán)丙沙星低水平耐藥（MIC＝8μg／mL）空彎外，所有環(huán)丙沙星耐藥空彎均存在此點的突變，質(zhì)控菌株及敏感菌不存在此突變。

在gyrA相關區(qū)域測序，發(fā)現(xiàn)93株環(huán)丙沙星耐藥彎曲菌存在C－257－T的點突變，低耐、敏感空彎及質(zhì)控菌株ATCC 33560不存在該突變。另外，環(huán)丙沙星耐藥空彎中存在多個沉默突變，未見其他有義突變。在gyrA相關區(qū)域中，存在最多的沉默突變是C－243－T和 C－357－T，存在于除質(zhì)控菌株 ATCC 33560外的所有受檢彎曲菌中；其他常發(fā)生的沉默突變包括 C－360－T、C－471－T、C－483－T、A－608－G、C－622－T。較少發(fā)生的沉默突變 T－603－C（n＝7，鄒平）、A－624－G（n＝2，龍口低耐及敏感菌株）和 C－645－T（n＝2，龍口低耐及敏感菌株），見表1。

gyrB基因相關區(qū)域測序顯示不存在有義突變。存在最多的位點沉默突變是C－1308－T和C－1360－T，分別有23株和22株；C－1467－T發(fā)生在采集自鄒平的2株菌株中；G－1383－A，C－1404－T和C－1413－T突變發(fā)生在同一株采集于鄒平的菌株中；另有16株環(huán)丙沙星耐藥空彎未檢測到任何突變，見表1。

對所有空彎進行parC的擴增，但并沒有成功。

表1 空彎gyrA和gyrB相關區(qū)域點突變情況

3 討論

細菌喹諾酮耐藥性和耐藥基因的貢獻關系密切。如存在于腸桿菌科細菌的qnr、qepA等，它們可多種細菌間廣泛傳播，幫助低耐細菌數(shù)量增加從而達到出現(xiàn)突變所需要的濃度，引起高水平耐藥［5］，本研究檢測了7種喹諾酮耐藥基因，但并沒有任何發(fā)現(xiàn)，這和之前的研究結果相同［10］。

空彎對喹諾酮類藥物的耐藥與gyrA基因上QRDR特異性點突變密切相關［10－12］。本研究經(jīng)檢測均存在gyrA上QRDR的熱點突變C－257－T。該點突變引起的Thr－86－Ile轉(zhuǎn)換能夠造成空彎對環(huán)丙沙星的高水平耐藥。另外，還有其他一些介導中介水平的喹諾酮耐藥的單突變?nèi)缁螂p重突變［9－10］在本研究中未有發(fā)現(xiàn)。本研究中除2株空彎（MIC＝8 μg／mL）外，其他環(huán)丙沙星耐藥空彎對環(huán)丙沙星的MIC≥32μg／mL［4］，未發(fā)現(xiàn)除C－257－T外的其他相關點突變，暗示在gyrAQRDR的C－257－T與彎曲菌環(huán)丙沙星高水平耐藥表型有明顯關系。

本研究中還通過測序在相關序列中發(fā)現(xiàn)多個沉默突變。部分沉默突變僅存在于一個或兩個地區(qū)的菌株中，這提示在同一地區(qū)中流行著具有相同沉默突變的gyrA、gyrB基因亞型。

有報道parC基因的突變能夠介導高水平喹諾酮耐藥［7］，本研究按照文獻引未能成功擴增parC基因，這和很多不同學者都沒能成功檢測出彎曲菌中存在parC，不能進行相關后續(xù)試驗［10］的報道結果一致，提示絕大多數(shù)空彎中不存在ParC。

綜上，本研究通過對采集自我國山東地區(qū)的雞源空彎進行喹諾酮類耐藥機制探討，確定菌株的高水平喹諾酮耐藥表型與gyrA上QRDR的熱點突變C－257－T密切相關。存在于gyrA和gyrB基因上的部分沉默突變有地域性流行特點。作為一種動物體內(nèi)共生，可治人類疾病的細菌，空彎耐藥性應引起足夠重視，加強對其的耐藥性監(jiān)控和耐藥性機制研究，對于獸醫(yī)、人醫(yī)了解空彎耐藥現(xiàn)狀，防控其傳播和流行有著重大的公共衛(wèi)生意義。

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