何書海

（信陽農(nóng)業(yè)高等?？茖W校動物科學系，河南 信陽464000）

中藥以其獨特的療效依然在獸醫(yī)臨床上發(fā)揮著其不可替代的作用。目前中獸藥以散劑、煎劑為主，藥效的發(fā)揮因劑型和采食限制而受到影響，配方顆粒劑因此應運而生。配方顆粒劑又稱作免煎劑，即是將單一中藥飲片經(jīng)過對有效成分提取加工濃縮后制成的顆粒劑，便于臨床調(diào)配［1］。它是發(fā)展我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥的一種有益嘗試，但中藥免煎組合方劑的藥效作用能否與傳統(tǒng)煎劑一致，這在學術界一直存有爭議［2］。雖然有研究對驗證免煎劑的藥效和質(zhì)量控制做了一些有益的嘗試，但要最終解決爭議、消除懷疑依然任重而道遠；因此對中藥材的不同劑型與免煎顆粒劑進行有效成分含量及藥效進行觀察比較將是一個有效的手段。為了更加客觀真實地觀察獸藥生產(chǎn)工藝對中藥有效成分含量及藥效的影響，根據(jù)前期研究內(nèi)容［3］，本試驗擬選用魚腥草利用獸藥生產(chǎn)中式生產(chǎn)設備將其制備成不同劑型，同時檢測相關指標，以期為探討免煎劑與傳統(tǒng)煎劑之間的關系提供科學佐證。

傳統(tǒng)醫(yī)學和現(xiàn)代醫(yī)學均證明，魚腥草具有抗菌、清熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、利尿之功效，在獸醫(yī)臨床上魚腥草常用于感染性疾病的治療。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，魚腥草的主要活性成分為揮發(fā)油和黃酮類化合 物，這類物質(zhì)具有清熱解毒、利尿通便、抗菌消炎、抗氧化、消除體內(nèi)自由基等藥理作用［4］，而槲皮素是黃酮類化合物的代表之一。結合本試驗為探討免煎劑與傳統(tǒng)煎劑之間關系的目的，本試驗擬檢測不同劑型魚腥草中槲皮素含量，同時觀察不同制劑魚腥草的體外抑菌效果。類似研究尚未見報道。

1 材料與方法

1．1 藥物 魚腥草干草（魚腥草洗凈60℃烘箱干燥2h左右至恒重），槲皮素標準樣品（分析純，Sig－ma公司提供），其余藥品均為分析純。

1．2 菌種與培養(yǎng)基 大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌（本校微生物實驗室提供）；葡萄糖酚紅肉湯（普通液體培養(yǎng)基含葡萄糖1%、酚紅0．002%）。

1．3 儀器 DC－NSG型實驗型提取濃縮機組（上海達程實驗設備有限公司）；DC－1500型實驗型噴霧干燥機（上海達程實驗設備有限公司）；TU－1810型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；JA2103N電子天平，TGL－16G高速離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1．4 魚腥草不同制劑的制備

1．4．1 制取工藝 （1）參照相關文獻［5］和預試驗結果，物料比選擇1∶15。即取魚腥草5 000g加水70 000mL，同時加乙醇和25%鹽酸（體積比為4∶1）混合提取液5 000mL，置于DC－NSG型實驗型提?。饪s）機組中進行回流提取。提取物料溫度為90℃，提取時間30min；濃縮物料溫度為80℃，真空度為0．06MPa，濃縮至5 000mL（料液比濃度為1g／mL）備用。（2）取上述濃縮液2 500mL置于DC－1500實驗型噴霧干燥機噴霧干燥，收集全部粉末，備用。

1．4．2 樣品處理及含量分析 根據(jù)槲皮素溶于乙醇的特點，將噴霧干燥原粉用80%乙醇稀釋，定容至2 500mL；再分別量取魚腥草濃縮原液（簡稱“原藥濃縮液”）和噴霧干燥粉醇溶液（簡稱“干粉醇溶液”）10．0mL置于 15mL離心管中，在10 000r／min條件下離心10min，移取上清液作為供試品溶液。

1．5 槲皮素標準曲線的制定 精密稱取槲皮素標準品10．000mg，置10mL容量瓶中，加80%乙醇溶解并定容，制成濃度為1mg／mL的儲備液。以此儲備液為參比液在200～500nm范圍用紫外可見分光光度計掃描，選擇適宜波長。分別量取儲備液0．0、0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5mL 于10mL容量瓶中，80%乙醇定容、搖勻，配制成質(zhì)量濃度分別為0．00、0．05、0．10、0．15、0．20、0．25、0．30、0．35 mg／mL的溶液，在適宜波長處測定吸收度，繪制標準曲線，計算回歸方程。

1．6 不同制劑中槲皮素含量測定 將上述供試液分別置于TU－1810型紫外可見分光光度計中，選擇適宜波長測定供試品的吸光度；由回歸方程計算出不同樣品中的槲皮素含量。

1．7 魚腥草不同制劑最小抑菌濃度（MIC）測定按《中國獸藥典》規(guī)定，魚腥草體外抑菌試驗濃度為1g／mL。分別取原藥濃縮液（原藥濃縮液組）和干粉水溶液（干粉水溶液組）分別對大腸桿菌、沙門菌、鏈球菌進行最小抑菌濃度的測定，每種細菌3個重復。在無菌條件下，將上述各藥液分別用葡萄糖酚紅肉湯作管外梯度稀釋，每種菌的1～9號管，藥物的稀釋濃度分別為1∶5，1∶10，1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640，1∶1 280，第10號管不加藥物作為對照，每管藥液均為1mL，每管菌量均為0．1mL，混合均勻，37℃培養(yǎng)24h，取出觀察細菌生長，對照管液體為紅色，細菌生長管為黃色。無細菌生長的最低藥物濃度即為對該菌株的最低抑菌濃度（MIC）。

2 結果

2．1 檢測波長的確定 以80%乙醇溶液為參比液，將槲皮素標準儲備溶液在200～500nm波長范圍內(nèi)掃描，得到其最大吸收波長分別位于256nm和362nm附近。結合前人研究結果［6］，本試驗采用362nm為測定波長對魚腥草的槲皮素含量進行測定。

2．2 槲皮素的標準曲線 以濃度（C）對吸光度（A）作標準曲線，并且進行線性回歸分析，結果表明，槲皮素標準溶液在濃度與吸光度之間呈現(xiàn)良好的線性關系。經(jīng)回歸處理得方程：C＝10．9770A0．0062（C＝mg／mL），決定系數(shù)r2＝0．9924。（圖1）。

圖1 槲皮素標準曲線與回歸方程

2．3 不同制劑中槲皮素的含量 如表1所示，通過紫外分析不同制劑中槲皮素的吸光值，結果表明，魚腥草原藥濃縮液中槲皮素的平均吸光度為0．253 7（λ＝362nm），干粉乙醇稀釋液中槲皮素的平均吸光度為0．246 1（λ＝362nm）。經(jīng)過回歸方程計算，原藥濃縮液中的槲皮素含量為2．778 7mg／mL，干粉乙醇稀釋液中槲皮素的含量為2．695 2mg／mL；兩組數(shù)值在統(tǒng)計學上無顯著差異。

表1 不同制劑中槲皮素吸光度值

2．4 不同制劑魚腥草抑菌效果 如表2所示，試驗結果表明，魚腥草原藥濃縮液對大腸桿菌、沙門菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度分別為12．5mg／mL、6．25mg／mL、3．12mg／mL，3次重復試驗顯示，在此濃度下抑菌效果有效率達到100%；魚腥草干粉乙醇稀釋液對大腸埃希氏菌、沙門菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為25．0mg／mL、6．25 mg／mL、6．25mg／mL，其中對沙門菌抑菌試驗時，在相應濃度下的3次重復試驗中2次有效。對其余兩種細菌的抑菌能力為100%。

表2 魚腥草不同制劑抑菌效果 （n＝3）

3 討論

本試驗利用實驗型回流提?。饪s）機組對魚腥草進行了提取和濃縮，同時利用噴霧干燥機對濃縮液制備成了干粉；該中試生產(chǎn)線型的提?。饪s）及干燥設備將更客觀真實地觀察生產(chǎn)設備及制備工藝對中藥有效成分及藥效的影響。吳景林［5］、羅顯華［7］等曾分別采取了索氏提取器回流提取、超聲波提取和簡單煎煮法對魚腥草槲皮素的提取工藝進行了研究，對于利用回流濃縮機組提取魚腥草有效成分的研究尚未見報道。本試驗通過對兩種魚腥草制劑中槲皮素有效含量的測定，結果顯示，兩種制劑工藝對槲皮素含量的影響在統(tǒng)計學上無明顯差異，但是從吸光度數(shù)值上觀察到魚腥草干粉醇溶液的吸光度對比原藥濃縮液有一定程度的降低。這可能是由于在噴霧干燥制粉中，制備工藝使部分槲皮素的含量減少，從而影響了吸光度。

有文獻表明［8－9］，魚腥草合成制劑以及魚腥草注射液的體外抑菌能力很強，其中對溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌等有明顯的抑制作用；對大腸埃希氏菌、痢疾桿菌等也有作用。本研究利用所制取的魚腥草原藥濃縮液和干粉醇溶液對大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌進行抑菌試驗，以期獲得不同制劑魚腥草的最小抑菌濃度。結果顯示，原來濃縮液對上述3種細菌的最小抑菌濃度均低于干粉醇溶液。魚腥草有效成分主要包括揮發(fā)油和黃酮類，揮發(fā)油內(nèi)抗菌有效成分主要包括癸酰乙醛、月桂醛、蒎烯和芳樟醇等，在利用蒸汽式噴霧干燥機對魚腥草濃縮液干燥時，使得大量的揮發(fā)油隨高溫蒸汽從排氣口逸散，因此影響了魚腥草的抑菌效果。

本試驗結果表明，在制備中藥免煎劑時制備工藝對藥物含量及藥效均有不同程度的影響。雖然中藥免煎顆粒劑替代煎劑是發(fā)展我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥的一種積極嘗試，但我國目前尚沒有統(tǒng)一的質(zhì)量控制標準，所以質(zhì)量控制研究是中藥免煎顆粒劑在獸醫(yī)臨床進一步推廣應用的基礎。姜泓等以藥材有效成分

提取率為指標，對麻黃、甘草、苦杏仁等進行了配方免煎劑的制備工藝和質(zhì)量控制研究，結果表明，以這些藥材制成配方顆粒免煎劑在工藝上是可行的，并以其有效成分作為質(zhì)量控制指標是合理的［10－11］。陳黎等采用薄層色譜法和高效液相色譜法對牛蒡子、炒牛蒡子及其免煎劑中主要成分牛蒡苷進行鑒別及含量測定，結果顯示，牛蒡子生品與炮制品中牛蒡苷的含量均符合藥典限度要求，免煎劑中牛蒡苷含量僅為炮制品中的三分之一［12］。蘇鑫等研究了保元湯不同調(diào)劑形式對脾虛小鼠負重游泳及MΦ吞噬功能的影響，結果發(fā)現(xiàn)，保元湯的傳統(tǒng)煎劑和免煎劑均對小鼠的免疫功能有一定的提高作用，而傳統(tǒng)煎劑的療效更為明顯［13］。雖然部分免煎中藥顆粒的療效與傳統(tǒng)飲片相近甚至效果更好，但不能肯定所有的配方臨床療效都等同于傳統(tǒng)的中藥煎劑。本試驗以單味中藥魚腥草進行了有效成分含量的測定和藥效的觀察，結果顯示，經(jīng)噴霧干燥后的魚腥草干粉對3種細菌的體外抑菌能力較原藥濃縮液要低；任非等通過對比10種中藥飲片和4種方劑的煎劑與免煎顆粒劑的抑菌作用發(fā)現(xiàn)，免煎顆粒劑的抑菌作用弱于煎劑［14］，與本研究有相似的結論?！叭核幑布濉笔侵兴幍闹饕厣?，從理論上講，中藥復方藥理作用并非等同于單味中藥成分提取后的簡單混合；多味藥物在高溫“共煎”之時會產(chǎn)生各種物理及化學變化，煎出成分較為復雜［15］。這些成分通過“君臣佐使”的關系發(fā)揮增強療效、緩和藥性的作用，這是免煎劑是無法做到的，因此免煎劑單味藥之和的藥理效應能否等同于傳統(tǒng)中藥煎劑，還有待進一步研究。

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