陳櫟娜，陸思琴，陳 荀，劉書亮

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安625014）

空腸彎曲桿菌是一種主要的食源性病原菌，是引起全世界人類細(xì)菌性腹瀉的主要原因［1］，可引起人的急性腸炎和食物中毒，并伴有反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、格林－巴利綜合征等免疫性疾?。?］。近年來，畜禽養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，大量抗生素被應(yīng)用到生產(chǎn)中，導(dǎo)致該菌的耐藥性顯著增加。關(guān)于空腸彎曲桿菌耐藥性的研究，主要在養(yǎng)殖場畜禽源，對于食源性菌株耐藥性的研究較少。本試驗對四川省雅安市市售雞肉進(jìn)行了調(diào)查，研究了其中空腸彎曲桿菌的污染率及耐藥性。

1 材料與方法

1．1 樣品 從雅安市定點屠宰場分4次共采集雞胸肉、雞翅、雞肝樣品共183份。

1．2 質(zhì)控菌株 空腸彎曲桿菌（C．jejuni）ATCC－33560。

1．3 藥品試劑 （1）培養(yǎng)基試劑：標(biāo)準(zhǔn)新生級牛血清，脫纖維羊血。（2）培養(yǎng)基：改良Skirrow氏瓊脂基礎(chǔ)，CCDA瓊脂基礎(chǔ)，布氏肉湯，哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)，M－H 培養(yǎng)基；Cary－Blair運送培養(yǎng)基，Skirrow瓊脂，哥倫比亞瓊脂。（3）抗生素：紅霉素（Erythromycin，EM），克林霉素（Clindamycin，CLI），環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIP），左氟沙星（Levofloxacin，LEV），鏈霉素（Streptomycin，STR），慶大霉素（Gentamicin，GEN），四環(huán)素（Tetracycline，TET），氟苯尼考（Florfenicol，F(xiàn)LO）。

1．4 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱；微量移液器；顯微鏡；顯微成像系統(tǒng)；超純水系統(tǒng)。

1．5 樣品的采集及運送 按 GB／T 4789．9－2003要求對雞肉、雞肝樣品進(jìn)行采樣。

1．6 菌株的分離純化 按張曉利［3］等創(chuàng)建的組合生化法進(jìn)行增菌培養(yǎng)及分離純化。

1．7 菌種鑒定

1．7．1 初步鑒定 根據(jù)菌落生長特征、革蘭染色特征、氧化酶試驗和過氧化氫酶試驗結(jié)果，按GB／T 4789．9－2003進(jìn)行。

1．7．2 二重PCR鑒定 （1）引物設(shè)計：針對彎曲菌屬16SrRNA基因的引物（16S－F和16S－R，序列為5′－gcgaagaacctaccyggrcttgata－3′ 和 5′－tcgcgrtattgcgtctcattgtatatg－3′，產(chǎn)物大小314bp）和空腸彎曲菌hipO 基因的引物（HIP－F 和 HIP－R，序列 5′－gatctgcaaaattagtggcg－3′為 5′－gcaaaggcaaagcatccat－3′，產(chǎn)物大小149bp），進(jìn)行設(shè)計。（2）PCR模板制備：挑取哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上的菌落于布氏肉湯中培養(yǎng)48h，用熱裂解法提取空腸彎曲桿菌DNA，將模板DNA置于－20℃?zhèn)溆?。?）PCR擴增：PCR 反應(yīng)體系：10× PCR Buffer 2．5μL、25 mmol／L MgCl21．5μL、dNTP mixture 2μL、模板1 μL、10μmol／L引物各0．5μL、Taq聚合酶0．5μL，補水至25μL。循環(huán)參數(shù)：（95℃，5min）＋［（95℃，35s）＋ （56．5℃，40s）＋ （72℃，45s）］×35＋（72℃，7min）。（4）PCR 產(chǎn)物的鑒定及分析：用0．5×TBE電泳緩沖液配制1．0%瓊脂糖凝膠溶液，100V電泳40min，于凝膠成像系統(tǒng)中拍攝分析電泳結(jié)果。（5）PCR鑒定為空腸彎曲桿菌的菌種進(jìn)行凍干保存，備用。

1．8 藥敏試驗

1．8．1 配制 按CLSI規(guī)定進(jìn)行藥液配制［4］，將藥物溶解，制成濃度為5 120μg／mL或2 560μg／mL的儲藏液，于－20℃冰箱保存。使用前稀釋到所需濃度。

1．8．2 試驗 （1）藥敏盒的制備：在無菌96孔板的各孔加入含10%新生牛血清的 M－H肉湯液100 μL，第一孔加入100μL藥物，梯度稀釋至最后一列，最后一孔吸取100μL混合液棄去。（2）接種和觀察結(jié)果：將M－H肉湯培養(yǎng)48h的菌液稀釋至0．5麥?zhǔn)媳葷峁?，用M－H肉湯稀釋100倍。取100μL接種于藥敏試劑盒，37℃微好氧條件下培養(yǎng)42h。加入0．5%TTC試劑1～2滴，培養(yǎng)30min，觀察結(jié)果，以空腸彎曲桿菌標(biāo)菌為質(zhì)控菌株，符合最低抑菌濃度（Minimum Inhibition Concentration，MIC）標(biāo)準(zhǔn)則判定菌株耐藥［5］。

2 結(jié)果與分析

2．1 初步鑒定 從183份雞肉中初步分離得到36株疑似菌株。在哥倫比亞血培養(yǎng)基上的菌落特征為不溶血、扁平、灰色不反光、半透明、白色、棕黃色凸起、邊緣不整齊、有時沿接種線向外擴散的典型菌落，在CCDA培養(yǎng)基上為灰白、濕潤的菌落。經(jīng)涂片作革蘭染色鏡檢為革蘭陰性菌，如小逗點狀，兩菌體的末端相連時，呈S形、海鷗形或螺旋狀。其過氧化氫酶試驗均呈陽性、氧化酶試驗均呈陽性，可初步判定為C．jejuni。

2．2 二重PCR鑒定 電泳結(jié)果表明（圖1），從C．jejuni標(biāo)準(zhǔn)株中擴增出兩個長約314bp和149bp的特異片段。根據(jù)所選擇的兩對特異性PCR引物對分離的36株疑似菌株進(jìn)行二重PCR檢測，其中25株C．jejuni能同時擴增出兩條目的條帶，其余菌株擴增出一條。綜上可知，本試驗從183份雞肉樣品中分離得到25株C．jejuni，污染率為13．66%。

2．3 藥敏試驗 肉湯微量稀釋法測定分離菌株對常見抗菌藥物的敏感性如表3所示，所有菌株對CIP、LEV耐受，對CLI、TET耐藥率較高，所有菌株對FLO，GEN敏感（表2）。88%的菌株顯示出多重耐藥性（表3）。

圖1 雞肉中空腸彎曲桿菌PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖

表2 雞肉中空腸彎曲桿菌分離株（25株）對8種藥物的耐藥率 （%）

表3 雞肉空腸彎曲桿菌耐藥譜

3 討論與結(jié)論

本試驗采用常規(guī)分離與二重PCR鑒定結(jié)合，從183份雞肉樣品中鑒定出C．jejuni25株，高于其他報道［3、6］，結(jié)果表明，調(diào)查的雞肉C．jejuni污染較嚴(yán)重，對消費者有潛在威脅。

獸藥在養(yǎng)殖業(yè)被廣泛使用，導(dǎo)致C．jejuni的耐藥性顯著增加，使該菌的耐藥性問題日益突出。試驗結(jié)果顯示，分離菌株對CIP、LEV耐藥率達(dá)100%，對CLI、TET和EM 的耐藥菌株分別為96%、84%和4%，對FLO、GEN敏感。國內(nèi)外研究表明C．jejuni對EM，CLI，CIP有不同程度耐藥性［7－8］，對 GEN 敏感。還有研究表明C．jejuni對CIP，TET 耐 藥 率 分別為 71．4%［9］，13．7%［8］，有30．6%的菌株顯示多重耐藥性［10］。試驗結(jié)果與以上研究比較，C．jejuni對CIP、LEV耐受性普遍較高，對CLI、TET的耐受率較之前研究報道明顯升高。雖然本試驗發(fā)現(xiàn)耐EM菌株較少，但仍需加強監(jiān)控。試驗表明C．jejuni對FLO、GEN的敏感性與國外研究報道一致。多重耐藥性會阻礙C．jejuni病的防治，特別是在禽畜養(yǎng)殖行業(yè)中。本試驗中88%分離菌株顯示出多重耐藥性，需在相關(guān)行業(yè)嚴(yán)格規(guī)范，遵守休藥期規(guī)定，控制耐藥性的產(chǎn)生和擴散，以預(yù)防疾病的發(fā)生。建立C．jejuni的污染現(xiàn)狀和耐藥性的資料文庫，為國家對C．jejuni病的預(yù)警、預(yù)防和治療具有重要意義。

［1］ 闞飆．新發(fā)現(xiàn)傳染病 ［M］．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004：195－202．

［2］ Ang C W，van Doorn P A，Endtz H P，etal．A case of Guillain－Bajrre syndrome following a family outbreak ofCampylobacterjejunienteritis［J］．J Neuroimmunol，2000（11）：29－32．

［3］ 張曉利．動物性食品源空腸彎曲桿菌的分離鑒定及其二重PCR檢測方法的建立 ［D］．四川：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009．

［4］ Clinical and Laboratory Standards Institute．Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically，Approved standard M7－A5，5th ed．Villanova［J］．PA：NCCLS；2002．

［5］ Andersen S R，Saadbye P，Sukri N M，etal．Antimicrobial resistance amongCampylobacterjejuniisolated from raw poultry meat at retail level in Denmark［J］．Int J Food Microbiol，2006，107（3）：250－255．

［6］ 吳平芳，賀連華，劉濤，等．深圳市食品空腸彎曲桿菌的污染情況調(diào)查［J］．熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2007，7（4）：368－369．

［7］ 姜毅．空腸彎曲桿菌耐藥性及其主要相關(guān)基因的初步分析．［D］．上海：上海交通大學(xué)，2008．

［8］ Wardak S，Szych J，Zasada A A，etal．Antibiotic resistance of Cmpylobacter jejuni and Campylobacter coli clinical isolates from Poland ［J］．Antimicrob Agents Chemother，2007，51（3）：ll23－l 125．

［9］ Padungtod P，Kaneene J B，Hanson R，etal．Antimicrobial resistance inCampylobacterisolated from food animals and humans in northern Thailand［J］．FEMS Immunol Med Microbiol，2006，47（2）：2 17－225．

［10］Schonberg－Norio D，Hanninen M L，Katila M L，etal．Activities of telithromycin，erythromycin，fluoroquinolones and doxycycline againstCampylobacterstrains isolated from Finnish subjects［J］．Antimierob Agents Chemother，2006，50（3）：1086－l088．