郝利華，畢言鋒，郭桂芳，劉自揚(yáng)，萬(wàn)仁玲

（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 海淀100081）

黃芪多糖注射液具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用，在獸醫(yī)臨床廣泛應(yīng)用。利巴韋林為人用抗病毒藥，移植獸用缺乏科學(xué)數(shù)據(jù)，用于動(dòng)物疫病不但給疫病防控帶來(lái)不良后果，而且影響疫病防控政策的實(shí)施，農(nóng)業(yè)部于2005年10月《農(nóng)業(yè)部第560號(hào)公告》中明確規(guī)定禁止獸用。根據(jù)目前獸藥市場(chǎng)反應(yīng)的情況，黃芪多糖注射液中有違規(guī)添加利巴韋林現(xiàn)象。本試驗(yàn)旨在建立黃芪多糖注射液中非法添加利巴韋林的HPLC－PDA定性、定量檢查方法，又用質(zhì)譜法對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行確證。試驗(yàn)結(jié)果表明，本方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、可行，為獸藥監(jiān)管提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1．1 儀器 高效液相色譜儀 Waters 2695，二極管陣列檢測(cè)器2998（PDA），美國(guó)Waters公司。

精密天平AE240精度0．01mg梅特勒精密儀器廠

1．2 試藥 利巴韋林對(duì)照品：中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：629－200202；供試品：市售黃芪多糖注射液；黃芪多糖提取物：中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，含量25%（以葡萄糖計(jì)）。

2 試驗(yàn)方法

2．1 溶液制備 對(duì)照品溶液：取利巴韋林對(duì)照品15mg，精密稱定，置50mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密量取5mL至25mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

陰性對(duì)照溶液：取黃芪多糖提取物4．0g，加水100mL，即得［1］。

供試品溶液：精密量取供試品1mL，置100mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取5mL置25mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。

2．2 色譜條件［2］采用資生堂利巴韋林專用柱（CAPCELL，PAK，Scx，UG80，4．6×250mm，5 μm）；以水（用硫酸調(diào)節(jié)pH 值至2．5±0．1）為流動(dòng)相；采用二極管陣列檢測(cè)器，采集波長(zhǎng)范圍為190 nm～400nm，分辨率為1．2nm，檢測(cè)波長(zhǎng)207nm；進(jìn)樣量20μL，流速0．3mL／min。理論板數(shù)按利巴韋林峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2．3 方法學(xué)考察

2．3．1 樣品本底及干擾 精密量取對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液各溶液20μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖和光譜指數(shù)圖，測(cè)定黃芪多糖成分對(duì)測(cè)定結(jié)果是否產(chǎn)生干擾。

結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2，黃芪多糖注射液本底對(duì)利巴韋林測(cè)定不產(chǎn)生干擾。

2．3．2 線性關(guān)系考察 取利巴韋林對(duì)照品30mg，置50mL量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1、3、5、7、9mL于25mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，測(cè)定。按利巴韋林峰面積與對(duì)應(yīng)的濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。利巴韋林回歸方程為y＝46 083x＋106，R2＝0．999 9。表明利巴韋林在24μg／mL～216μg／mL濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2．3．3 檢測(cè)限與定量限 黃芪多糖儲(chǔ)備液：取陰性對(duì)照溶液0．15mL［2］置50mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。

檢測(cè)限溶液制備：取2．1對(duì)照品溶液適量（可適當(dāng)稀釋）、加黃芪多糖儲(chǔ)備液5mL于25mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，測(cè)定。光譜指數(shù)圖失真前的濃度為本法的檢測(cè)限，S／N≥10的濃度為定量限。該色譜條件下利巴韋林檢測(cè)限為2μg／mL，定量限 為6μg／mL。

圖1 陰性對(duì)照溶液光譜圖、色譜圖

圖2 利巴韋林對(duì)照品光譜圖、色譜圖

2．3．4 回收率試驗(yàn) 取利巴韋林對(duì)照品12mg、15 mg、18mg，精密稱定，置50mL量瓶中，分別加黃芪多糖注射液各0．15mL，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取5mL于25mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，按上述色譜條件測(cè)定，每個(gè)濃度測(cè)定3份平行樣。回收率結(jié)果見(jiàn)表1。

2．4 供試品測(cè)定 取市售黃芪多糖注射液25批（不同廠家），按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

2．5 質(zhì)譜確證條件［3］色譜條件：Waters ACQUITY UPLC液相色譜儀；ACQUITY C18色譜柱（100 mm×2．1mm i．d．，1．7μm）；流速0．3mL／min；柱溫35℃；流動(dòng)相A為0．1%甲酸乙腈溶液，流動(dòng)相B為0．1%甲酸水溶液；梯度洗脫程序：0～0．5min，A相比例為2%；0．5～3min，A相比例由2%線性變化至20%。進(jìn)樣體積2μL。

質(zhì)譜條件：Waters HDMS四級(jí)桿－飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Q－TOF MS），離子源為電噴霧正電離模式（ESI＋），毛細(xì)管電壓3．0kV，錐孔電壓20V；采用碰撞能量梯度（MSE）功能同時(shí)采集MS和 MS2信息，低碰撞能設(shè)為4V，高碰撞能梯度范圍設(shè)為10～20V；離子源及脫溶劑氣溫度分別為120℃和350℃；脫溶劑化氣體流速設(shè)為650L／h。TOF MS質(zhì)量采集方式為全掃描，范圍為m／z 50至300Da，樣品分析前用甲酸鈉溶液進(jìn)行質(zhì)量數(shù)校正。另外，采用亮氨酸－腦啡肽溶液（LE，m／z 566．2771）為L(zhǎng)ock mass實(shí)時(shí)校正精確質(zhì)量數(shù)。

表1 利巴韋林回收率

表2 黃芪多糖注射液中利巴韋林含量測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)果與分析

通過(guò)對(duì)比對(duì)照品和供試品色譜圖的保留時(shí)間，發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)的25批黃芪多糖注射液中，3批添加了利巴韋林，對(duì)照品溶液中的利巴韋林與供試品溶液中的添加物質(zhì)PAD光譜一致，檢出波長(zhǎng)均為206 nm，色譜保留時(shí)間一致，證明其中添加了利巴韋林［4］，見(jiàn)圖3。

圖3 HPLC－PDA光譜指數(shù)圖（上）及色譜圖（下）

為了進(jìn)一步確證檢出利巴韋林，又采用了超高效液相色譜－四級(jí)桿－飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行分析，對(duì)比對(duì)照溶液和樣品溶液的保留時(shí)間（RT）和質(zhì)譜碎片離子（MS2）。對(duì)照品溶液中，利巴韋林（m／z245）的選擇離子檢測(cè)監(jiān)測(cè)色譜圖（EIC）和MS2全掃描質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3（a），其中，RT為1．14min，主要碎片離子有m／z113和 m／z96。供試品溶液中利巴韋林的EIC和 MS2全掃描質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3（b），其RT和MS2信息與對(duì)照溶液完全相同，說(shuō)明供試品溶液中確實(shí)含有利巴韋林，見(jiàn)圖4。

4 討論

4．1 本試驗(yàn)在做回收試驗(yàn)時(shí)，按利巴韋林注射液規(guī)格［2］為100%添加，在實(shí)際供試品測(cè)定中發(fā)現(xiàn)有的樣品不只添加一種成分，可檢出兩種或兩種以上，添加量各不相同，故在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)節(jié)供試品的稀釋倍數(shù)。

4．2 本試驗(yàn)采用色譜柱為利巴韋林專用柱，柱平衡時(shí)間比較長(zhǎng)，可先采用純水以1．0mL／min的流速過(guò)夜沖洗，再經(jīng)流動(dòng)相以0．3mL／min的流速進(jìn)行平衡。

4．3 HPLC－PDA檢測(cè)方法利用待測(cè)物與其對(duì)應(yīng)的對(duì)照品有相同的最大吸收波長(zhǎng)，兩者之間的偏差應(yīng)在±2nm之內(nèi)，另根據(jù)保留時(shí)間的一致性可確定檢出藥物與其對(duì)應(yīng)對(duì)照品為同一物質(zhì)，而進(jìn)行定性與定量測(cè)定［5－6］。在測(cè)定的色譜圖中，待測(cè)物的保留時(shí)間應(yīng)與其對(duì)應(yīng)的利巴韋林對(duì)照品的保留時(shí)間一致。

5 結(jié)論

通過(guò)本試驗(yàn)，確定了黃芪多糖注射液中非法添加利巴韋林的定性和定量檢測(cè)方法，方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、且可行。

［1］ 獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)2003年版［S］．

［2］ 中國(guó)藥典二○一○年版二部［S］．

［3］ 寧素云，郭興杰，張紅，等．HPLC法同時(shí)檢測(cè)清熱解毒類中成藥中非法添加的9種化學(xué)藥品［J］．中國(guó)藥事，2009，23（9）907－910．

［4］ 吳小紅，李煥德．高效液相色譜法－二極管陣列檢測(cè)器同時(shí)分析測(cè)定中成藥及保健品中非法添加的9種糖皮質(zhì)激素［J］．中南藥學(xué)，2009，5，7（5）：324－327．

［5］ 王曉飛，葛海生，于玲，等．中成藥中非法添加對(duì)乙酰氨基酚的檢測(cè)［J］．江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，6，21（3）：72－73．

［6］ 劉吉金，楊敏，李軍，等．HPLC同時(shí)檢測(cè)保健品及中成藥中非法添加9種抗高血壓化學(xué)藥物的研究［J］，中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2008，25（8）：717－719．