丁鵬，周長勝，戴孝森，陸斌，王崇謙，王偉民，王進(jìn)昆

20世紀(jì)90年代初，Reynolds和Richards等先后從成年鼠的紋狀體和海馬中分離出神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)[1-2]，打破了成體哺乳動(dòng)物神經(jīng)細(xì)胞不能再生的傳統(tǒng)觀念。NSC除在特定的胚胎發(fā)育期存在外，在成年哺乳動(dòng)物大腦中也分布廣泛，其中側(cè)腦室壁的腦室下區(qū)和海馬齒狀回的顆粒下區(qū)是NSCs分布的兩個(gè)主要區(qū)域[3]。研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生病理改變后，NSCs會(huì)特異性地向損傷部位遷移，并可替代缺失的細(xì)胞，從而恢復(fù)受損腦組織結(jié)構(gòu)和功能[4-8]。我們先前通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)體外可趨化神經(jīng)干細(xì)胞遷移，其趨化遷移作用與濃度正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)探討MCP-1在體對NSCs遷移的趨化作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性Sprague-Dawley大鼠36只，鼠齡4～5個(gè)月，體重(300±25)g，購于昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)過程對動(dòng)物的處理符合2006年科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)意見》的規(guī)定[9]。

1.2 試劑與儀器

兔抗大鼠nestin多克隆抗體、兔抗大鼠MCP-1多克隆抗體、兔SP Kit、DAB Kit、HE染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；革蘭氏陰性菌胞壁脂多糖(LPS)購自SIGMA公司；大鼠腦立體定向儀購自中西遠(yuǎn)大科技有限公司。

1.3 模型制備

參照文獻(xiàn)腦皮質(zhì)微量注射內(nèi)毒素建立腦損傷模型[10]。分為：①對照組：顱內(nèi)注射生理鹽水5μl；②實(shí)驗(yàn)組：顱內(nèi)注射脂多糖5μl(脂多糖5μg溶于生理鹽水5μl)。兩組均再分為3 d、5 d、7 d組，每組6只。實(shí)驗(yàn)過程死亡者，按相同數(shù)量補(bǔ)充。

1.4 標(biāo)本采集與處理

按文獻(xiàn)方法于造模后3 d、5 d、7 d取材[10]。3%H2O2去離子水(無色液體)孵育8 min，PBS沖洗5次，每次3 min；滴加山羊血清工作液室溫孵育10 min，傾去；滴加1∶100一抗(兔抗大鼠nestin多克隆抗體、兔抗大鼠MCP-1多克隆抗體、兔SP Kit)，4℃冰箱過夜，PBS沖洗5次，每次5 min；滴加生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育15 min。PBS沖洗5次，每次5 min；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育15 min，PBS沖洗5次，每次5 min；顯色劑顯色(DAB)，自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，封片。

切片高倍鏡下采用圖像分析軟件ImagePro-Plus 6.0分析，記錄累積吸光度值(IA值)表示，免疫反應(yīng)產(chǎn)物的IA值減去背景的IA值，得到矯正IA值(CIA值)即免疫反應(yīng)產(chǎn)物的實(shí)際累積吸光度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MCP-1

MCP-1陽性產(chǎn)物為棕黃色點(diǎn)狀或顆粒狀沉積，主要分布細(xì)胞胞質(zhì)中。各時(shí)間點(diǎn)對照組MCP-1在皮質(zhì)、海馬、腦干部位均有少量表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組造模后3 d時(shí)，MCP-1除了在上述部位表達(dá)外，主要在損傷邊緣表達(dá)；造模后5 d表達(dá)到峰值，范圍擴(kuò)大至損傷周圍；造模后7 d表達(dá)量和范圍較前減少(圖1)。

對照組各時(shí)間點(diǎn)MCP-1 CIA值無顯著性差異(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)組MCP-1各時(shí)間點(diǎn)CIA值均顯著高于對照組(P＜0.001)。見表1。

表1 各組MCP-1表達(dá)(CIA值)

圖1 各組MCP-1表達(dá)(免疫組化染色，200×)

2.2 nestin

nestin陽性產(chǎn)物為棕黃色點(diǎn)狀或顆粒狀沉積，主要在細(xì)胞內(nèi)。各時(shí)間點(diǎn)對照組大鼠nestin陽性細(xì)胞在海馬區(qū)表達(dá)，量較少。實(shí)驗(yàn)組造模后3 d見中等量nestin陽性細(xì)胞在海馬區(qū)表達(dá)；5 d海馬區(qū)大量表達(dá)，并向損傷區(qū)遷移；7 d損傷區(qū)可見nestin陽性細(xì)胞(圖2)。

對照組各時(shí)間點(diǎn)nestin CIA值無顯著性差異(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對照組(P＜0.001)。見表2。

表2 各組nestin表達(dá)(CIA值)

圖2 實(shí)驗(yàn)組nestin表達(dá)(免疫組化染色)

3 討論

在腦損傷、癲癇、神經(jīng)細(xì)胞變性等[4-8]時(shí)，NSCs可被激活，發(fā)生增殖、遷移和分化，恢復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)的正常結(jié)構(gòu)和功能。目前調(diào)控NSCs增殖和遷移的機(jī)制還不完全清楚，可能與以下因素有關(guān)[11-15]：細(xì)胞周圍環(huán)境、細(xì)胞代謝產(chǎn)物、細(xì)胞因子、黏附分子、激素和遞質(zhì)等。

有學(xué)者認(rèn)為以MCP-1為代表的趨化因子可能發(fā)揮著重要作用[16]。MCP-1屬于CC類趨化因子，由Yoshimura于1989年首次從神經(jīng)膠質(zhì)瘤系U-105MG分離純化得到[17]，是一種具有多種生物學(xué)功能的趨化因子。它通過與表面受體CCR2結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起與細(xì)胞遷移或激活相關(guān)的一系列細(xì)胞內(nèi)變化[18-19]。腦內(nèi)MCP-1主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元表達(dá)。正常腦組織MCP-1維持在較低水平，當(dāng)受到損傷時(shí)，表達(dá)水平上調(diào)。

Yamagami等的研究顯示，在小鼠局灶性腦缺血模型中，缺血區(qū)皮質(zhì)和基底節(jié)MCP-1表達(dá)上調(diào)，腦室下區(qū)的NSCs向缺血區(qū)定向遷移[20]。Belmadani等的研究顯示，敲除小鼠MCP-1或CCR2基因后，NSCs向損傷區(qū)的遷移顯著減少[21]。本課題組先前證實(shí)，MCP-1在體外可趨化神經(jīng)干細(xì)胞遷移，其趨化作用與濃度成正相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)NSCs表達(dá)趨化因子MCP-1的特異性受體CCR2[22]。以上研究提示，MCP-1-CCR2軸可能參與了神經(jīng)修復(fù)的過程。但是其在體內(nèi)促進(jìn)NSCs的增殖與遷移的機(jī)制尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)通過制備腦皮質(zhì)微量注射脂多糖腦損傷模型，應(yīng)用冰凍切片免疫組織化學(xué)染色法，動(dòng)態(tài)監(jiān)測MCP-1和nestin陽性細(xì)胞的時(shí)相變化。發(fā)現(xiàn)損傷后，MCP-1表達(dá)的量和范圍增加，5 d時(shí)達(dá)到高峰；同時(shí)觀察到海馬區(qū)nestin陽性細(xì)胞增殖，7 d時(shí)損傷區(qū)可見nestin陽性細(xì)胞。考慮可能是趨化因子MCP-1的升高趨化表達(dá)其特異性受體的NSCs向損傷區(qū)遷移，即在腦皮質(zhì)微量注射脂多糖腦損傷模型中，MCP-1有一過性增加，而升高的MCP-1對NSCs從海馬區(qū)向損傷區(qū)遷移可能具有正性誘導(dǎo)作用。

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