何 寧 朱毅林 車國良

長沙市八醫(yī)院骨科，湖南長沙 410002

1 研究背景

某些腫瘤細(xì)胞不單對原使用的藥物產(chǎn)生耐藥，同時(shí)對與之結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制完全不同的藥物也會產(chǎn)生交叉耐藥現(xiàn)象，這一現(xiàn)象被稱為多藥耐藥（multidrugre sistance，MDR）[1]。國內(nèi)外許多研究證實(shí)了腫瘤多藥耐藥是由P糖蛋白（P-gp170）介導(dǎo)，P-gp170為細(xì)胞膜表面的一種分子量約170KD的糖蛋白，細(xì)胞的抗藥性是通過P170蛋白的作用而實(shí)現(xiàn)的[1]。因P170蛋白的藥物外排泵作用，降低了細(xì)胞內(nèi)藥物的有效濃度，使腫瘤細(xì)胞逃逸了化療藥物的細(xì)胞毒作用，表現(xiàn)出抗藥性。近年發(fā)現(xiàn)中藥單體川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）具有鈣離子阻滯作用，而鈣離子阻滯劑多有化療增敏，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥作用。本實(shí)驗(yàn)采用體外進(jìn)行骨肉瘤耐藥細(xì)胞（MG-63/ADM）的培養(yǎng)，觀察川芎嗪及聯(lián)用阿霉素在下調(diào)骨肉瘤耐藥細(xì)胞（MG-63/ADM）中P-170蛋白的表達(dá)的作用。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 細(xì)胞系 人骨肉瘤（MG-63）細(xì)胞以及骨肉瘤（MG-63）耐藥細(xì)胞系購于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。

2.1.2 主要試劑和儀器 試劑：磷酸川芎嗪、阿霉素粉針、鏈霉素粉針和青霉素粉針、RPMI-1640液體培養(yǎng)基、胰蛋白酶、MTT粉FITC標(biāo)記鼠抗人P-gp抗體。儀器：IX70倒置顯微鏡、Galaxys二氧化碳培養(yǎng)箱、LXJ-Ⅱ低速離心機(jī)、Centrifuge 5415高速離心機(jī)、電熱恒溫干燥箱、-20℃、4℃冰箱、超聲波破碎儀、流式細(xì)胞儀FACSCalibur。

2.2 方法

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)條件 人骨肉瘤（MG-630細(xì)胞以及骨肉瘤（MG-63）耐藥細(xì)胞在37℃，5%CO2飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2.2 MTT法測定骨肉瘤耐藥細(xì)胞的耐藥性 本實(shí)驗(yàn)MTT法是參照Scheltema的MTT法以及MTT法的影響因素的相關(guān)文獻(xiàn)[2-3]，實(shí)驗(yàn)具體步驟如下：①取對數(shù)生長MG-63細(xì)胞，用0.25%胰酶分散細(xì)胞，吹打成細(xì)胞懸液，取適量細(xì)胞懸液染色后上細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行記數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度為3×104/mL，每孔180 μL細(xì)胞懸液植入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37℃，100%濕度、含5%CO2實(shí)驗(yàn)條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。②待96孔板內(nèi)細(xì)胞貼壁后，分別設(shè)有7組：對照組（1組不加任何藥物），實(shí)驗(yàn)組（2～7組）各組內(nèi)藥物組合以及藥物濃度如表1所示。

表1 MTT實(shí)驗(yàn)各組內(nèi)藥物濃度

逆轉(zhuǎn)耐藥骨肉瘤細(xì)胞的川芎嗪的濃度的確定是根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，用 MTT法確定該藥物對細(xì)胞生長率＞95%的藥物濃度為非細(xì)胞毒性劑量[1]。用 MTT法檢測川芎嗪對MG-63/ADM耐藥細(xì)胞生長率＞95%的藥物濃度為20 ng/mL以下。

③培養(yǎng)4～6 h后，給96孔板每孔加入MTT20μl（5 mg/mL），至MTT沉淀完全溶解，上酶標(biāo)儀檢測其分光光度值，測定570nm波長下吸光度值（OD值）取3孔OD值的平均數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

用統(tǒng)計(jì)軟件13.0計(jì)算出各組藥物對細(xì)胞的相應(yīng)的IC50值（藥物殺傷細(xì)胞的50%的藥物劑量）。用下式計(jì)算耐藥細(xì)胞的耐藥倍數(shù)[4]：耐藥倍數(shù)=培養(yǎng)后的耐藥細(xì)胞IC50值/培養(yǎng)前的細(xì)胞IC50值

2.2.3 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞P糖蛋白（P-gp）的表達(dá) 分別用含有2.5 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL和20 ng/mL的川芎嗪的RPMI-1640細(xì)胞液體培養(yǎng)基培養(yǎng)MG-63/ADM耐藥細(xì)胞72 h后，以0.25%的胰酶消化后收集1×106個(gè)細(xì)胞。上流式細(xì)胞儀檢測8～10×103個(gè)細(xì)胞，測定P糖蛋白（P-gp）的表達(dá)陽性率。每組檢測3個(gè)平行標(biāo)本，最終結(jié)果取三個(gè)結(jié)果的均值。本實(shí)驗(yàn)對照組為加藥培養(yǎng)前的原始細(xì)胞，同樣收集1×106個(gè)細(xì)胞，按照上述過程處理，但不用抗體標(biāo)記。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

運(yùn)用SPSS 13.0軟件包對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，主要包括：單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)等。均取P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 MG-63/ADM耐藥細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

MG-63/ADM耐藥細(xì)胞可以在含0.29 ng/mL阿霉素（ADM）的1640液體培養(yǎng)基中生長。誘導(dǎo)培養(yǎng)的MG-63/ADM耐藥細(xì)胞的耐藥倍數(shù)是11.62。流式細(xì)胞儀測定MG-63/ADM耐藥細(xì)胞的P糖蛋白（P-gp）表達(dá)是強(qiáng)陽性，表達(dá)率為69.86%。兩種細(xì)胞相關(guān)參數(shù)比較見表2。

表2 不耐藥MG-63和耐藥細(xì)胞相關(guān)參數(shù)的比較

3.2 流式細(xì)胞檢測骨肉瘤細(xì)胞的P170表達(dá)的結(jié)果

①不耐藥骨肉瘤細(xì)胞P170表達(dá)（均數(shù)為10.55%）；②耐藥骨肉瘤細(xì)胞P170表達(dá)（均數(shù)為69.86%）；③用2.5 ng/mL的川芎嗪處理耐藥細(xì)胞后的P170表達(dá)（均數(shù)為60.26%）；④用5 ng/mL的川芎嗪處理耐藥細(xì)胞后的P170表達(dá)（均數(shù)為55.07%）；⑤用10 ng/mL的川芎嗪處理耐藥細(xì)胞后的P170表達(dá)（均數(shù)為46.85%）；⑥用20 ng/mL的川芎嗪處理耐藥細(xì)胞后的P170表達(dá)（均數(shù)為36.2%）。

流式細(xì)胞儀檢測經(jīng)過或未經(jīng)過TMP處理的骨肉瘤耐藥細(xì)胞P170蛋白的表達(dá)率結(jié)果見以上。不耐藥的骨肉瘤細(xì)胞P170蛋白的表達(dá)率為10.55%；而耐藥的骨肉瘤細(xì)胞P170蛋白的表達(dá)率高達(dá)69.86%。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組和對照組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），各組P170表達(dá)率經(jīng)過兩兩比較，差異均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明TMP對骨肉瘤耐藥細(xì)胞的P170表達(dá)具有明顯的下調(diào)作用。

4 討論

許多腫瘤都有發(fā)生多藥耐藥的現(xiàn)象，雖然MDR的確切發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，但研究證實(shí)：P-170蛋白的過度表達(dá)是其主要機(jī)制之一[5]。因此，研制新的化療增效劑，提高腫瘤對化療的敏感性，特別是國外研究多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)劑或是耐藥調(diào)節(jié)劑[6]，提高骨肉瘤腫瘤細(xì)胞對化療藥物的反應(yīng)成了進(jìn)一步改善骨肉瘤患者生存率的重要途徑。

本實(shí)驗(yàn)非細(xì)胞毒濃度的川芎嗪與阿霉素聯(lián)用在下調(diào)骨肉瘤耐藥細(xì)胞（MG-63/ADM）的P-170蛋白表達(dá)的程度，從而探討其逆轉(zhuǎn)骨肉瘤耐藥細(xì)胞耐藥性的機(jī)制。

4.1 培養(yǎng)的骨肉瘤耐藥細(xì)胞的耐藥性

本實(shí)驗(yàn)中的MG-63/ADM耐藥細(xì)胞的耐藥倍數(shù)是11.62，同時(shí)流式細(xì)胞儀測定MG-63/ADM耐藥細(xì)胞的P170（P-gp）表達(dá)是強(qiáng)陽性。應(yīng)證了骨肉瘤耐藥性和骨肉瘤的P170表達(dá)具有明顯的相關(guān)性。

4.2 TMP對骨肉瘤耐藥細(xì)胞的P170表達(dá)的下調(diào)作用

當(dāng)川芎嗪的濃度從2.5 ng/mL，增加到5、10、20 ng/mL時(shí)，耐藥細(xì)胞的P170相應(yīng)地表達(dá)率為60.26%、55.07%、46.85%、36.2%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，經(jīng)過川芎嗪處理的細(xì)胞組和未經(jīng)過川芎嗪處理的細(xì)胞組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＜ 0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明非細(xì)胞毒濃度的TMP對骨肉瘤耐藥細(xì)胞的P170表達(dá)具有一定下調(diào)作用。

4.3 TMP對骨肉瘤耐藥細(xì)胞的耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TMP對骨肉瘤耐藥細(xì)胞的P170表達(dá)具有一定下調(diào)作用；由此可見，TMP對骨肉瘤耐藥細(xì)胞的耐藥性有部分逆轉(zhuǎn)的作用，其機(jī)制之一是TMP可以下調(diào)腫瘤細(xì)胞膜上的P170蛋白的表達(dá)從而可能減少P170蛋白對ADM的外排作用，進(jìn)而達(dá)到更好地殺傷骨肉瘤耐藥細(xì)胞的效果；是否還有其它機(jī)制存在，還需要進(jìn)一步研究。

總之，川芎嗪具有下調(diào)骨肉瘤MG-63/ADM耐藥細(xì)胞的P-170蛋白的表達(dá)從而降低骨肉瘤細(xì)胞耐藥性的作用。

[1] Min YD，Yang MC，Lee KH，et al.Protoberberine alkaloids and their reversal activity of P-gp expressed multidrug resistance（MDR）from the rhizome of Coptis japonica Makino[J].Arch Pharm Res，2006，29（9）：757-761.

[2] Loo T W，Bartlett MC，Clarke DM.Drug binding in human P-glycoprotein causes conformational changes in both nucleotide-binding domains[J].J Biol Che m，2003，278（50）：1575-1578.

[3] A WGATI QA.Regulation of ion channels by ABC transporters that secrete ATP[J].Science，1995，269（l）：805.

[4] Fuji H，Tanigawa N，Muraoda R，et al.Detection of P-g1ycoprotein by flow cytometry[J].Anticancer Res，1993，13：2171.

[5] Homicek FJ，Gebhardt Mc，Wolfe MW，et al.P-glycoprotein levels predict poor outcome in patients with osteosarcoma[J].J Clin Orthop，2000，373（1）：11-l7.

[6] Scotlandi K，Serra M，Nicoletti G，et al.Cancer Res，1996，56（10）：2434-2439.