謝 婷，饒康太，陳 雄，高順清，魯 江，王 志*

（1.湖北工業(yè)大學(xué)，湖北 武漢 430068；2.深圳華潤(rùn)九新藥業(yè)有限公司，廣東 深圳 518049）

農(nóng)業(yè)廢棄物的增益化利用是循環(huán)生態(tài)農(nóng)業(yè)非常重要的環(huán)節(jié)，隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)的發(fā)展，每年7億t的作物秸稈產(chǎn)量和預(yù)計(jì)到2020年將達(dá)到42億t的畜糞年排放量成為生態(tài)農(nóng)業(yè)資源化利用以及可持續(xù)發(fā)展亟待解決的問(wèn)題和研究熱點(diǎn)[1]，如秸稈、畜糞等農(nóng)業(yè)廢棄物在厭氧條件下轉(zhuǎn)化為沼氣的研究[2-3]。雖然秸稈中存在纖維素和木質(zhì)素等分子形成的特殊結(jié)構(gòu)[4]和木質(zhì)素芳環(huán)降解物對(duì)厭氧菌群的毒性[5]以及畜糞秸稈厭氧體系易于“基質(zhì)酸化”等而使沼氣產(chǎn)量的穩(wěn)定性降低[6]，但是纖維素、木質(zhì)素等大分子還是可以被厭氧耦合菌系有效降解[7]?！盎|(zhì)酸化”從本質(zhì)上是厭氧體系細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸等小分子有機(jī)酸的能力大于甲烷菌群利用其為碳源和能源來(lái)合成甲烷的能力所造成[8]，因此可以通過(guò)大量補(bǔ)加產(chǎn)甲烷菌[9]和向酸化體系中補(bǔ)加能利用畜糞厭氧產(chǎn)氨的細(xì)菌[10]來(lái)緩解碳代謝失衡而降低酸化程度，但是由于兩者純培養(yǎng)的技術(shù)難度妨礙了其大規(guī)模應(yīng)用。

厭氧條件下，多數(shù)兼性厭氧菌（如芽胞桿菌、大腸桿菌、糞產(chǎn)堿菌、假單胞菌等）能將有機(jī)物氧化放出的電子傳遞給硝酸鹽同時(shí)釋放能量[11]。當(dāng)沒(méi)有硝酸鹽或其可獲得性不足時(shí)，兼性細(xì)菌可通過(guò)發(fā)酵作用將電子直接傳遞給中間產(chǎn)物，產(chǎn)生乙酸等小分子有機(jī)酸，而其在厭氧體系中被甲烷菌系利用而產(chǎn)生甲烷。當(dāng)該代謝耦合作用失衡時(shí)，酸化由此產(chǎn)生[8，12]。因此，硝酸鹽的可獲得性可能成為緩解或解決秸稈畜糞厭氧體系產(chǎn)沼氣系統(tǒng)酸化的易行方法。本文在秸稈畜糞厭氧發(fā)酵體系中添加硝酸鹽和兼性產(chǎn)氨菌株，考察其對(duì)厭氧發(fā)酵過(guò)程中基質(zhì)利用、體系pH值和揮發(fā)性脂肪酸（VFA）代謝以及沼氣產(chǎn)量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 發(fā)酵原料

水稻秸稈（含水率小于10%），粉碎后過(guò)40目篩后備用。新鮮牛糞（總固形物含量TS為15.6%）或/和豬糞（總固形物含量TS為13.9%）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)裝置

采用橡膠塞封口的250mL抽濾瓶作為反應(yīng)器，出氣口連接橡膠管并浸沒(méi)固定于15%NaOH溶液的量筒內(nèi)。抽濾瓶位置高于量筒，以免倒吸。反應(yīng)器置于37℃恒溫水浴鍋中。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵體系裝配

自然厭氧發(fā)酵體系：5g秸稈粉裝入250mL的抽濾瓶中，添加牛糞或/和豬糞（牛糞和豬糞混合時(shí)，其比例為2∶1）30g，加蒸餾水200mL后立即將瓶口用橡膠塞封閉，出氣橡膠管固定于集氣裝置。

以兼性氨化菌為接種物的秸稈畜糞發(fā)酵體系：5g秸稈粉裝入250mL的抽濾瓶中，添加牛糞和豬糞（混合比例2∶1）30g，接入在LB液體培養(yǎng)基中活化12h的兼性厭氧氨化菌——糞產(chǎn)堿菌（Af）或/和蘇云金芽孢桿菌（Bt）30mL（Af生物量為1.6g/L，Bt生物量是1.8g/L），再加蒸餾水170mL后立即將瓶口用橡膠塞封閉，出氣橡膠管固定于集氣裝置。

1.2.2 分析檢測(cè)方法

產(chǎn)沼氣量檢測(cè)：采用水壓法收集發(fā)酵產(chǎn)生的氣體，根據(jù)排出的15%NaOH溶液的體積定時(shí)記錄產(chǎn)氣量。

發(fā)酵液pH值：用pH值計(jì)測(cè)定。

揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的檢測(cè)參照文獻(xiàn)[13-14]的方法進(jìn)行。

每組試驗(yàn)數(shù)據(jù)取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 秸稈畜糞（牛糞或/和豬糞）體系發(fā)酵產(chǎn)氣及體系pH值情況

秸稈畜糞（牛糞或/和豬糞）體系自然發(fā)酵產(chǎn)氣過(guò)程和最終pH值見(jiàn)圖1、圖2。

秸稈畜糞（牛糞或/和豬糞）體系自然發(fā)酵厭氧培養(yǎng)168h后培養(yǎng)體系的產(chǎn)氣趨勢(shì)基本相似，產(chǎn)氣量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而提高。牛糞、豬糞和牛糞/豬糞體系平均產(chǎn)氣速率分別為0.68mL/h、1.31mL/h和1.22mL/h，后兩者產(chǎn)氣效率比前者分別提高了93%和79%。這與后兩者所含成分比牛糞更富營(yíng)養(yǎng)有關(guān)。如所分析的那樣，三者在厭氧發(fā)酵過(guò)程中均發(fā)生了嚴(yán)重的酸化現(xiàn)象，三者的最終pH值為5.1～5.6。產(chǎn)氣速率與pH值之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系，酸效應(yīng)的存在使得體系產(chǎn)氣效率下降。新鮮牛糞中含纖維質(zhì)比較多，而豬糞因含較多的蛋白類(lèi)組分而緩解基質(zhì)酸化的程度，提高了菌群甲烷合成能力。但是，體系酸化仍然發(fā)生了。以牛糞體系pH值最低（5.13），豬糞和牛糞/豬糞體系pH值差異不大，在5.5左右。由于研究目標(biāo)是秸稈畜糞體系，因此選擇牛糞/豬糞（2∶1）作為發(fā)酵體系底物之一。

圖1 不同畜糞對(duì)體系厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的影響Fig.1 Effect of straw and manure anaerobic fermentation system on the biogas production

圖2 不同畜糞對(duì)體系厭氧發(fā)酵pH值的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）Fig.2 Effect of straw and manure anaerobic fermentation system on pH value(Means±standard deviation)

基于對(duì)體系酸化機(jī)制的理解，通過(guò)補(bǔ)加前期篩選的兼性產(chǎn)氨細(xì)菌——糞產(chǎn)堿菌（Af）和蘇云金芽胞桿菌（Bt，同時(shí)接種2株菌的接種比例為1∶1）以觀(guān)察其對(duì)體系pH值和產(chǎn)氣的影響。

2.2 兼性氨化菌對(duì)秸稈畜糞體系發(fā)酵產(chǎn)氣及體系pH值的影響

體系接種糞產(chǎn)堿菌或/和蘇云金芽胞桿菌，秸稈畜糞體系厭氧發(fā)酵最終產(chǎn)氣量和pH值見(jiàn)圖3、圖4。

接種糞產(chǎn)堿菌或/和蘇云金芽胞桿菌，秸稈畜糞體系厭氧發(fā)酵168h的產(chǎn)氣趨勢(shì)基本相似，產(chǎn)氣量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，產(chǎn)氣速率先加快，后逐漸減慢，最終產(chǎn)氣量分別為205mL、195mL和220mL，后者分別比前兩者提高了7.2%和12.8%。

圖3 接種兼性氨化菌對(duì)秸稈畜糞體系發(fā)酵產(chǎn)氣的影響Fig.3 Effects of facultative ammonifying bacteria addition on biogas production in the anaerobic straw and manure fermentation system

圖4 兼性氨化菌對(duì)秸稈畜糞體系pH值的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）Fig.4 Effects of facultative ammonifying bacteria addition on pH value in the anaerobic straw and manure fermentation system(Means±standard deviation)

添加糞產(chǎn)堿菌或/和蘇云金芽胞桿菌菌液后體系pH值不同，其中同時(shí)添加糞產(chǎn)堿菌和蘇云金芽胞桿菌體系的pH值最高，為5.83。添加糞產(chǎn)堿菌或蘇云金芽胞桿菌的pH值相當(dāng)，分別為5.70和5.76，均低于同時(shí)添加2種菌體系的pH值。

和圖2相比，接種兼性氨化菌的厭氧發(fā)酵體系的pH值均高于自然厭氧發(fā)酵體系的pH值，提高了2.9%～13.6%，可見(jiàn)接種兼性氨化菌有利于提高體系pH值，但pH值的緩沖效果仍然不理想，pH值仍在6.0以下。

由于在厭氧條件下，兼性厭氧菌如糞產(chǎn)堿菌和芽胞桿菌等能通過(guò)硝酸鹽呼吸來(lái)產(chǎn)生能量[11]及可能降低或緩解發(fā)酵產(chǎn)酸效應(yīng)。因此，選擇牛糞/豬糞（2∶1）和接種兼性產(chǎn)氨細(xì)菌——糞產(chǎn)堿菌和蘇云金芽胞桿菌為基本厭氧體系，觀(guān)察硝酸鹽和氨化菌接種量對(duì)體系pH值的影響。

2.3 硝酸鉀對(duì)秸稈畜糞接種氨化菌體系發(fā)酵產(chǎn)氣及體系pH值的影響

由于硝酸鉀、氨化菌的復(fù)合作用可能調(diào)節(jié)體系厭氧發(fā)酵的pH值，穩(wěn)定體系產(chǎn)氣效率，因此，對(duì)兩者進(jìn)行了初步優(yōu)化見(jiàn)表1。Af/Bt指糞產(chǎn)堿菌和芽胞桿菌接種菌液體積比例。

表1 加硝酸鉀和氨化菌對(duì)pH值的影響Table 1 Effects of potassium nitrate and ammoniation bacteria additions on pH value

表2 雙因素方差分析（α=0.05）Table 2 Variance analysis of two factor(α=0.05)

從表1可以看出，相同氨化菌接種比例時(shí)，體系pH值基本上都是隨著硝酸鉀添加濃度的增大而提高。硝酸鉀濃度是1g/L和3g/L時(shí)，pH值基本上不隨氨化菌接種比例的變化而變化。最優(yōu)組合方案是：2g/L硝酸鉀以及糞產(chǎn)堿菌/蘇云金芽孢桿菌為1∶2。此條件下，體系最終pH值最高，為7.12。

由表2可知，運(yùn)用Excel方差分析當(dāng)α=0.05時(shí)，硝酸鉀對(duì)體系pH值影響極為顯著。氨化菌只是具有厭氧硝酸鹽呼吸的能力，但是，當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中硝酸鹽的可獲得性不足時(shí)，氨化菌并不能誘導(dǎo)并表現(xiàn)出硝酸鹽呼吸的功能，因而其單獨(dú)使用的緩沖pH值效果并不明顯。

最優(yōu)組合方案條件下體系產(chǎn)氣和pH值的情況見(jiàn)表3。

表3 硝酸鉀對(duì)秸稈畜糞接種兼性氨化菌體系發(fā)酵產(chǎn)氣及體系pH值的影響Table 3 Effects of nitrate addition on biogas production and pH value in straw manure inoculated with the facultative ammoniation bacteria system fermentation

由表3可知，優(yōu)化條件下厭氧發(fā)酵168h的產(chǎn)氣量為350mL，比對(duì)照組（只添加氨化菌）顯著提高了62.8%。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)優(yōu)化組VFA含量為2.54g/L，比對(duì)照減少了13.0%。這也反映出更多的揮發(fā)性有機(jī)酸被甲烷菌群利用了，體系VFA的降低顯著緩沖了體系的pH值，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，添加組pH值為7.12，比對(duì)照提高了22.8%。同時(shí)也表明：秸稈畜糞厭氧體系產(chǎn)沼氣的限制性因子不是體系VFA的生成效率，而是VFA積累到臨界濃度以上所造成的過(guò)低pH值。

硝酸鉀的加入使兼性厭氧菌群（包括糞產(chǎn)堿菌和芽胞桿菌）在厭氧體系的電子受體可獲得性增加，實(shí)現(xiàn)了電子由VFA合成途徑向硝酸鹽呼吸的代謝遷移[15-16]，緩沖了體系pH值，提高了厭氧菌系的代謝活性，促進(jìn)了有機(jī)物向沼氣轉(zhuǎn)化的效率。

3 結(jié)論

秸稈畜糞（牛糞或/和豬糞）體系厭氧發(fā)酵過(guò)程發(fā)生了基質(zhì)酸化現(xiàn)象，最終pH值為5.2～5.5，雖然接種兼性氨化菌的厭氧發(fā)酵體系比自然厭氧發(fā)酵體系的pH值提高了2.9%～13.6%，但體系pH值仍在6.0以下。當(dāng)硝酸鉀的添加量為2g/L以及氨化菌（糞產(chǎn)堿菌/蘇云金芽胞桿菌的接種比例為1∶2）時(shí)，厭氧發(fā)酵168h的產(chǎn)氣量為350mL，比對(duì)照組（只添加氨化菌）顯著提高了62.8%，此時(shí)VFA含量為2.54g/L，比對(duì)照減少了13.0%。這也反映出更多的揮發(fā)性有機(jī)酸被甲烷菌群利用了，體系VFA的降低顯著緩沖了體系的pH值，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，添加組pH值為7.12，比對(duì)照提高了22.8%。

硝酸鉀對(duì)體系pH值影響極為顯著，而氨化菌只是具有厭氧硝酸鹽呼吸的能力，但是，當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中硝酸鹽的可獲得性不足時(shí)，氨化菌并不能誘導(dǎo)并表現(xiàn)出硝酸鹽呼吸的功能，因而其單獨(dú)使用的緩沖pH值效果并不明顯。硝酸鉀的加入提高了體系pH值和厭氧菌系的代謝活性，促進(jìn)了有機(jī)物向沼氣轉(zhuǎn)化的效率。同時(shí)也說(shuō)明秸稈畜糞厭氧體系產(chǎn)沼氣的限制性因子不是體系VFA的生成效率，而是VFA積累到臨界濃度以上所造成的過(guò)低pH值。

本研究結(jié)果為秸稈畜糞體系厭氧條件下因“基質(zhì)酸化”而使沼氣產(chǎn)量降低矛盾的解決提供了一種易行策略。

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