郝大林

肝癌是指發(fā)生于肝細胞或肝內(nèi)膽管上皮細胞的癌變，是我國常見惡性腫瘤之一?；蛑委熓墙陙磲t(yī)療技術發(fā)展中的重要成果，對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的抑制具有良好的效果。本研究以血管抑素基因聯(lián)合放射性藥物32P-膠體治療大鼠肝癌的研究，對治療效果進行評價。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與器材 TUNEL熒光試劑盒（北京中昊時代生物有限公司），總RNA提取試劑盒（上海拜力生物科技有限公司），顯微鏡為奧林巴斯FV500激光顯微鏡，CT機為GE公司生產(chǎn)的螺旋CT機，32P-膠體購自原子高科股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 血管抑素基因的構(gòu)建 以試劑盒提取總RNA，血管抑素基因下游引物為5’-TTATGAGCACCGCTTCAGGTTGC AGTAT-3’，上有引物為5’-CGAAGCTTGGATCCATGGAC CATAAGGAAGTAA-3’。根據(jù)標準方法擴增RT-PCR，將擴增之后增加的物質(zhì)接入pMD18T克隆載體，進行血管抑素基因的重組構(gòu)建，進行鑒定測序后再次擴增并進行質(zhì)粒提取。

1.2.2 模型制備與分組 選取購自省實驗動物中心的健康Wistar雄性大鼠（吉檢證字2002A044），大鼠體重在140～150g。以中國醫(yī)學科學院提供的Walker-256腫瘤細胞0.05mL在大鼠肝葉位置接種，進行肝癌的動物模型建立。7d后進行腫瘤大小檢查。將大鼠隨機分為3組，分別為基因治療組、聯(lián)合治療組、對照組，3組大鼠均為30只。將大鼠行開腹暴露肝臟部分與腫瘤組織，分3個點進行腫瘤注射，主要藥物量為20mL，基因治療組注射20μg血管抑素基因質(zhì)粒，聯(lián)合治療組注射20μg血管抑素基因質(zhì)粒與32P-膠體，對照組注入0.2mL生理鹽水。

1.3 評價方法[1]分別在治療前、治療后7、14、21d行CT檢查，測量腫瘤體積，計算腫瘤生長率。治療21d后處死大鼠，取腫瘤組織并固定、切片，進行顯微鏡檢查，以免疫組化的方法進行腫瘤微血管密度（MVD）測量，以TUNEL方法進行細胞凋亡指數(shù)（AI）測定。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件分析，計量資料以(±s)表示，組間進行t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠治療后的腫瘤生長率檢測結(jié)果比較 基因治療組與聯(lián)合治療組治療后7、14、21d腫瘤生長率均顯著低于對照組（P＜0.01），聯(lián)合治療組治療后7、14、21d腫瘤生長率均顯著低于基因治療組（P＜0.01）。見表1。

表1 3組大鼠治療后的腫瘤生長率檢測結(jié)果比較（±s，%）

表1 3組大鼠治療后的腫瘤生長率檢測結(jié)果比較（±s，%）

注：與對照組比較，aP＜0.01；與基因治療組比較，bP＜0.01

組別 例數(shù) 7d 14d 21d基因治療組 30 5.87±1.88a 15.79±2.43a 23.93±4.98a聯(lián)合治療組 30 2.71±1.39ab 4.77±1.85ab 6.82±2.55ab對照組 30 8.53±1.42 24.89±5.21 45.32±8.83

2.2 3組大鼠治療后MVD與AI檢測結(jié)果比較 治療21d后，基因治療組與聯(lián)合治療組MVD與對照組相比均顯著降低（P＜0.01），AI與對照組相比均顯著升高（P＜0.01）?；蛑委熃MMVD與聯(lián)合治療組相比均明顯增加（P＜0.05），基因治療組AI與聯(lián)合治療組相比明顯降低（P＜0.05）。見表2。

表2 3組大鼠治療后MVD與AI檢測結(jié)果比較（±s）

表2 3組大鼠治療后MVD與AI檢測結(jié)果比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.01；與治療組相比bP＜0.05

組別 例數(shù) MVD(n) AI(%)基因治療組 30 46.02±7.71ab 15.64±3.53ab聯(lián)合治療組 30 30.02±3.38a 24.95±4.04a對照組 30 61.78±10.67b 5.51±1.49b

3 討論

血管抑素和重組的血管抑素蛋白直接注射于實驗動物體內(nèi)，能明顯抑制腫瘤原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的血管生成?；蚬こ痰难杆侔l(fā)展為血管抑素的基因治療提供了實驗基礎。血管抑素和內(nèi)皮抑素血管抑素是人纖溶酶原的片斷。血管抑素在體外表現(xiàn)出抑制內(nèi)皮細胞增殖、遷移和血管形成，而在體內(nèi)則表現(xiàn)為抑制血管形成和轉(zhuǎn)移[2]?？紤]到血管抑素需要大劑量多次注射以及長期治療，這使其失去臨床試驗的吸引力。血管抑素更具潛力的是它和體外放療的聯(lián)合應用。本研究實驗數(shù)據(jù)顯示，在不增加毒性作用下聯(lián)合離子放射和血管抑素，能提高腫瘤的清除。這暗示血管抑素與其他治療聯(lián)合應用時更加有效，而不應只是作為基礎治療。由于抗腫瘤血管生成基因治療不受腫瘤細胞周期的影響，故而是化療、放療和其他基因治療方案的良好補充。血管抑素的抗血管治療與傳統(tǒng)的抗腫瘤細胞治療的聯(lián)合應用，能更有效地治療腫瘤。本次研究中腫瘤體積、MVD、AI的變化證明血管抑素能夠抑制腫瘤生長，而聯(lián)合放射性藥物32P-膠體相比血管抑素單一作用更為明顯，可以通過抑制腫瘤血管內(nèi)皮細胞生長與發(fā)展遷移而抑制腫瘤生長，能夠有效控制肝癌病情、改善治療效果。

[1]劉志廣.AD-AS-ES(血管抑素/內(nèi)皮抑素雙基因腺病毒表達載體)體外對肺癌A549細胞作用的初步研究[D].哈爾濱醫(yī)科大學，2010.

[2]馬鐸，于峰，高慧棋，等.血管抑素基因聯(lián)合32P-膠體治療大鼠肝癌的療效[J].中國老年學雜志，2011，31(21):4202-4204.