譚維國，陳文琦，呂 恒，劉 玉，王 平，陳鳳娟，王長軍，張錦海

(本文編輯:張仲書; 英文編輯:王建東)

炭疽桿菌能引起羊、牛、馬等動(dòng)物及人類的炭疽病，嚴(yán)重威脅公眾財(cái)產(chǎn)、健康和生命安全，并且可形成氣溶膠通過空氣飛沫傳播，易引發(fā)突發(fā)公共衛(wèi)生事件，也常常被視為首選的生物恐怖/生物戰(zhàn)病原［1-2］。目前的炭疽桿菌檢測方法，主要基于對病原體的培養(yǎng)、染色鏡檢、血清學(xué)(抗原或抗體)檢測等，但這些方法均不適合早期快速偵檢，難以適應(yīng)戰(zhàn)時(shí)疫情控制的需要［3-4］。本研究選擇了炭疽桿菌PX01質(zhì)粒的保護(hù)性抗原PA基因、PX02質(zhì)粒的莢膜合成相關(guān)基因capA基因作為檢測靶基因，從而建立了一種雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，能區(qū)分強(qiáng)毒株、弱毒株或無毒株，對于應(yīng)對突發(fā)傳染病疫情和流行病學(xué)調(diào)查、突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置的早期檢測、及反生物恐怖襲擊預(yù)警等具有重要的意義，并已應(yīng)用在某次重大保障活動(dòng)中。

1 材料與方法

1.1 材料 ①菌株和質(zhì)粒:炭疽桿菌強(qiáng)毒株(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院五所微檢中心);大腸埃希菌XL10-Gold株(美國Stratagene公司);線性化質(zhì)粒載體pGEM-T easy(美國Promega公司)。②主要試劑:DNA提取液(25 mM NaOH、10 mM Tris-HCl、1%Triton X-100、1%NP-40、0.1mM EDTA、2%Chelex-100)、Pyrobest Taq DNA聚合酶、DNA連接酶、DNAMarker DL2000、DNA純化及片段回收、抽提質(zhì)粒試劑盒、RNase H酶TliRNase H II、Taq DNA聚合酶Ex Taq HS等，均為TaKaRa公司(大連)產(chǎn)品;細(xì)菌DNA抽提試劑盒(北京天根公司)。③主要設(shè)備:ABI 7500 Fast型實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀(美國 ABI公司，配套軟件SDS2.04)。

1.2 方法

1.2.1 引物、探針的設(shè)計(jì) 通過分別對NCBIGen-Bank中的炭疽桿菌的PA基因和capA基因序列，使用Beacon Designer等多種生物學(xué)軟件，結(jié)合經(jīng)驗(yàn)判斷和人工比對、修正，進(jìn)行比較分析，選擇無二級結(jié)構(gòu)且高度保守的核苷酸區(qū)域，各設(shè)計(jì)一對引物和探針。設(shè)計(jì)原則為:引物間和引物內(nèi)無互補(bǔ)序列，而且分別特異性地針對各靶基因，相互間無交叉反應(yīng)，溶解溫度(Tm值)相似，可在同一套反應(yīng)體系中同時(shí)應(yīng)用于檢測和區(qū)分炭疽桿菌的PA和capA基因。

1.2.2 引物對及探針序列的合成 委托Takara(大連)公司合成，引物、探針序列和雙標(biāo)記的熒光基團(tuán)見表1。

1.2.3 目標(biāo)基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 用細(xì)菌DNA抽提試劑盒按照說明書操作，從滅活的炭疽桿菌強(qiáng)毒株中提取基因組DNA。分別按表1的capA引物對序列、PA引物對序列，使用Pyrobest Taq DNA聚合酶對細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得對應(yīng)的capA基因片段、PA基因片段目標(biāo)基因擴(kuò)增產(chǎn)物，送交南京金斯瑞生物公司，拼接克隆至PGEM-T easy載體，經(jīng)測序驗(yàn)證無誤，稱為 CapA-PA-PGEM質(zhì)粒。將含CapA-PA-PGEM質(zhì)粒的XL10-Gold細(xì)菌進(jìn)行增菌，提取質(zhì)粒DNA，用紫外分光光度計(jì)定量，利用阿伏加德羅常數(shù)公式(6.02×1023)×(ng/μl×10－9)/(DNA 長度 ×660)= 拷貝/μl計(jì)算拷貝數(shù)［5］，根據(jù)需要稀釋分裝，從而獲得同時(shí)含有capA基因序列和PA基因序列的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，置－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 反應(yīng)體系 反應(yīng)總體積25μl，采用正交設(shè)計(jì)L16(45)考察 Mg2+、dNTPs、引物濃度、探針濃度、Ex Taq HS酶五因素，在四個(gè)水平上進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，最終確定的體系由以下組分構(gòu)成:dNTP混合溶液(各2.5 mM)3 μl，MgCl2溶液(25 mM)5 μl，Tli RNase HⅡ(200 U/μl)0.5 μl，Ex Taq HS(5 U/μl)0.25 μl，10 ×Cycleave PCR Buffer 2.5 μl，PA、capA 引物對工作液(10μM)各1μl，PA探針工作液、capA探針工作液(均為5μM)各1μl，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1μl或樣本待測液4μl，最后以雙蒸水補(bǔ)足至25μl。

1.2.5 反應(yīng)參數(shù) 第一階段:初期變性，95℃10 s;第二階段:PCR反應(yīng)，為95℃變性5 s，55℃退火10 s，然后72℃ 25 s延伸，并在此步驟監(jiān)測熒光曲線;重復(fù)50個(gè)循環(huán)以更好地觀察雙重實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線的形狀。判斷陽性的標(biāo)準(zhǔn)是:循環(huán)閾值(Ct值)在38以內(nèi)且擴(kuò)增曲線呈S型。

1.2.6 靈敏度實(shí)驗(yàn) 將CapA-PA-PGEM質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作倍比連續(xù)稀釋，使其拷貝數(shù)濃度從5×106拷貝/μl至 5 ×10－1拷貝/μl，然后加入反應(yīng)體系內(nèi)進(jìn)行雙重?zé)晒釶CR擴(kuò)增，測定雙重實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏度。

1.2.7 特異性實(shí)驗(yàn) 用建立的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法對課題組保存的炭疽桿菌強(qiáng)毒株核酸、鼠疫桿菌核酸、嗜肺軍團(tuán)菌1型、鼠傷寒沙門菌、山夫登堡沙門菌、福氏志賀菌、宋內(nèi)志賀菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 25922)、弗勞地枸櫞酸桿菌、銅綠假單胞菌進(jìn)行檢測比較。

1.2.8 實(shí)戰(zhàn)應(yīng)用 在某次重大保障任務(wù)中，對解放軍總后勤部衛(wèi)生部提供的一次實(shí)毒實(shí)樣(白色粉末)進(jìn)行涂片革蘭染色后發(fā)現(xiàn)背景雜亂，并見少許革蘭陽性桿菌，隨即對粉末樣品用DNA抽提液按常規(guī)方法提取核酸，以本研究建立的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行檢測分析。

表1 引物對及探針序列

2 結(jié)果

2.1 炭疽桿菌雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)熒光曲線圖 用本研究建立的方法，對炭疽桿菌強(qiáng)毒株核酸檢測的熒光曲線見圖1。

圖1 炭疽的CapA基因、PA基因的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

可見在單一反應(yīng)孔中，同時(shí)成功檢測出capA基因、PA基因，擴(kuò)增曲線良好，呈典型的S型

2.2 靈敏度 經(jīng)梯度稀釋的CapA-PA-PGEM質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品測試，本方法對capA基因、PA基因單檢的靈敏度分別為每反應(yīng)5和50拷貝，見表2。

表2 炭疽桿菌雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測靈敏度

2.3 特異性 應(yīng)用本研究的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR方法，對保存的炭疽桿菌強(qiáng)毒株或核酸樣品的檢測結(jié)果均為陽性，而鼠疫桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌1型、枯草芽孢桿菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株等形態(tài)相似桿菌、常見致病菌或條件致病菌的檢測結(jié)果均為陰性。

2.4 實(shí)戰(zhàn)應(yīng)用 對解放軍總后勤部衛(wèi)生部提供的實(shí)毒實(shí)樣，在嚴(yán)格生物安全防護(hù)條件下提取核酸后，應(yīng)用本方法進(jìn)行實(shí)戰(zhàn)應(yīng)用檢測，結(jié)果陽性對照(質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品)、陰性對照均確立，待測樣品孔的熒光曲線圖見圖2。由圖2可見待測樣品所含的細(xì)菌capA基因檢測陰性，PA基因檢測陽性?？紤]為capA基因缺失或已敲除的炭疽桿菌弱毒株(疫苗株)。經(jīng)測序及上報(bào)檢測結(jié)果后的反饋信息證實(shí)，檢測結(jié)果完全正確。

圖2 實(shí)毒樣品的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測曲線

3 討論

炭疽桿菌致病性與其PX01質(zhì)粒上的保護(hù)性抗原基因(PA)和PX02質(zhì)粒上的莢膜合成相關(guān)基因(capA)相關(guān)，如果只有其中一種質(zhì)粒，即為弱毒株或無毒株［6-7］。在發(fā)生疫情和突發(fā)公共衛(wèi)生事件中，因預(yù)警、控制及應(yīng)急反應(yīng)決策的需要，對于炭疽桿菌更需同時(shí)檢測PA和capA，以區(qū)分是否存在炭疽桿菌并鑒定區(qū)分強(qiáng)毒株或弱毒、無毒株［8-9］。因此，建立一種炭疽桿菌的雙重檢測方法具有顯著的針對性和實(shí)用性［10-11］。

本研究成功構(gòu)建了同時(shí)含有炭疽桿菌capA基因片段、PA基因片段的重組質(zhì)粒CapA-PA-PGEM，經(jīng)測序正確，準(zhǔn)確定量后，以此為標(biāo)準(zhǔn)品，建立了雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。由圖1的熒光曲線可見，兩個(gè)體系各自的特異性和工作性能良好，互相間無干擾;當(dāng)capA基因?yàn)槊糠磻?yīng)5拷貝數(shù)、PA基因?yàn)槊糠磻?yīng)50拷貝數(shù)時(shí)，用本方法仍然能夠檢出。同時(shí)檢測時(shí)FAM通道(capA)信號明顯比JOE通道(PA)信號強(qiáng)，除引物探針性能外，也有可能是報(bào)告熒光的差異(目前FAM是使用最廣泛和穩(wěn)定的熒光基團(tuán))或基因表達(dá)豐度的問題，但并不影響實(shí)際應(yīng)用［12］。對枯草芽孢桿菌、枸櫞酸桿菌、鼠疫桿菌核酸、嗜肺軍團(tuán)菌、各型沙門菌、志賀菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等進(jìn)行檢測，均為陰性，本法特異性較好。除上述實(shí)驗(yàn)室考驗(yàn)外，本研究建立的方法還在實(shí)戰(zhàn)中得到檢驗(yàn)，在某重大保障活動(dòng)中，對實(shí)毒實(shí)樣(白色粉末)進(jìn)行檢測時(shí)準(zhǔn)確鑒定出混入的少量炭疽桿菌弱毒株［13］。

本研究建立了能同時(shí)檢測炭疽桿菌PA基因、capA基因的雙重實(shí)時(shí)熒光 PCR的技術(shù)，在具有快速準(zhǔn)確、高靈敏度的特點(diǎn)同時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)一管多檢，省時(shí)省力，極大地提高了檢測速度和效率，對于應(yīng)對突發(fā)傳染病疫情及突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置的早期檢測，反生物恐怖襲擊預(yù)警等都具有重要的意義。

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