王 潔，李利平，王衛(wèi)萍，李曉軍

(本文編輯:張仲書; 英文編輯:王建東)

目前已證明，90%以上的急性上呼吸道疾病和大部分的下呼吸道疾病是由細(xì)菌以外的病原體引起，其中以呼吸道病毒最常見［1-2］，包括流感病毒A(FluA)、流感病毒 B(FluB)、呼吸道合胞病毒(RSV)A型、B型以及副流感病毒1型、3型等。近年來，新發(fā)呼吸道傳染病如SARS、禽流感等疾病的爆發(fā)，給人類社會和國民經(jīng)濟帶來很大負(fù)擔(dān)［3］。由于這些病毒引起的感染癥狀和流行特點相似，僅靠臨床癥狀及常規(guī)檢測方法進(jìn)行病原的確定非常不可靠［4］，因此迫切需要一種高靈敏度和特異性的方法可以同時準(zhǔn)確地鑒別診斷和快速識別病原體，對預(yù)防疾病的傳播和患者的診斷治療至關(guān)重要。

本研究將靶序列富集多重-聚合酶鏈反應(yīng)(target enriched multiplex PCR，Tem-PCR)和 Luminex液相芯片(multiple analytes profiling，xMAP)技術(shù)有機結(jié)合，克服了病毒分離培養(yǎng)、血清學(xué)診斷及單一PCR的缺點，可以在單個反應(yīng)體系中檢測出4種常見病毒引起的呼吸道感染。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 pCR○RⅡ載體、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)及脫氧核糖核酸酶I(DnaseⅠ)等購自上海Invotrizen公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒(QIAprep Spin Miniprep Kit)和 cDNA第一鏈合成試劑盒(Quantscipt RT Kit)購自德國QIAGEN公司，Wizard SV凝膠及PCR純化系統(tǒng)(Wizard SV Gel and PCR Clean-up System)、ApaⅠ限制性內(nèi)切酶、SP6 RNA 聚合酶及 rNTP購自 Promega公司，Trans Start TM TaqDNA聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)公司，RNA磁珠柱提取試劑盒購自上海之江生物科技有限公司，PCR儀購自美國ABI公司，Luminex Liquidchip 200系統(tǒng)及配套耗材購自上海透景生命科技有限公司。

1.2 引物和探針序列的設(shè)計及合成 從NCBI下載病毒的靶標(biāo)核酸序列，利用Primer Premier 5.0軟件分析并設(shè)計位于保守區(qū)內(nèi)的病毒特異性引物(Fo、Fi、Ro、Ri)和特異雜交探針(De)，其中 Fi引物的3’端和Ri引物的5’端分別加入一段非同源性序列作為通用引物(RSP，F(xiàn)SP)，構(gòu)成特異性嵌合引物，上、下游通用引物的5’端均標(biāo)記生物素，最終在與熒光編碼微球探針雜交時，與結(jié)合有熒光素的鏈親和素反應(yīng)，成為報告信號。所有引物、探針的合成及修飾由上海Invotrizen公司完成(表1)。

1.3 靶標(biāo)病毒體外轉(zhuǎn)錄RNA 為避免在研究過程中接觸有致病性危險的真正病原體，需要設(shè)計和制備針對每一種病毒檢測的靶標(biāo)RNA。本文研究涉及的4種呼吸道病毒基因組均為RNA，因此根據(jù)RNA模板的堿基序列首先人工合成DNA，并將合成的DNA片段克隆到pCR○RⅡ載體中，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，經(jīng)PCR、酶切、測序鑒定靶標(biāo)序列正確后，對質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和純化，獲得體外轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)RNA即IVT-RNA。利用紫外分光光度計測定濃度和純度，并根據(jù)分子量和核酸濃度計算拷貝數(shù)。

1.4 Tem-PCR反應(yīng) 本文作為對方法學(xué)的可行性研究和初步表征，采用體外合成的靶標(biāo)病毒RNA(IVT-RNA)為檢測對象，模擬臨床標(biāo)本將其加入咽拭子采集液的裂解液中，磁珠柱法提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行Tem-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系:10×Buffer 2.5 μl，dNTPs(2.5 mM)2 μl，Trans Start TM TaqDNA聚合酶(2.5 U)1 μl，上、下游特異外引物(Fo和 Ro:0.1 μmol/L)各 1 μl，上、下游嵌合引物(Fi和 Ri:0.4 μmol/L)各 1 μl，上游通用引物(FSP:1 μmol/L)1 μl，下游通用引物(RSP:4 μmol/L)1 μl，模板1 μl，去 RNA 酶水補足至25 μl。反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃ 15 min;特異和嵌合引物擴增94 ℃30 s、56 ℃ 35 s、72 ℃ 20 s，15 個循環(huán);通用引物擴增93 ℃ 20 s、57 ℃ 25 s、71 ℃ 15 s，35個循環(huán);最后72℃延伸3 min，4℃保存。

1.5 PCR產(chǎn)物雜交和液相芯片檢測

1.5.1 探針微球的制備 由上海透景生命科技有限公司制備針對每一種病毒的探針微球，2～8℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物和探針序列

1.5.2 雜交反應(yīng)和檢測 取1.5×四甲基氯化銨溶液(tetramethylammonium chloride solution，TMAC)22μl，加上述制備好的4種探針微球包被液各0.1 μl和PCR產(chǎn)物3μl，95℃變性5 min，48℃雜交59 min，此時加入預(yù)熱的鏈霉親和素稀釋液(streptavidin-r-phycoerythrin，SA-PE)75 μl繼續(xù)反應(yīng) 15 min。結(jié)束后用Luminex Liquidchip 200系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.6 檢測體系特異性驗證 為了檢查是否針對某種病毒的探針會和其他病毒非特異性結(jié)合產(chǎn)生交叉反應(yīng)信號，在反應(yīng)體系中加入針對4種病毒的微球探針混合物，但每個反應(yīng)體系只加一種病毒模板(1 μl，相當(dāng)于4.5 ×103個拷貝數(shù))，檢測每種微球上的信號值。通過比較非目標(biāo)病毒微球熒光信號值與背景熒光信號值，評估檢測系統(tǒng)的特異性。

1.7 檢測體系靈敏度實驗 體外轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)RNA經(jīng)過紫外分光光度計定量后換算為拷貝數(shù)，對其倍比稀釋，獲100至103的4個濃度梯度的 IVT-RNA。模擬臨床標(biāo)本將其分別加入咽拭子采集液的裂解液中，磁珠柱法提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，各取1μl作為模板，檢測靈敏度。實驗非同日3次平行進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行，定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 靶標(biāo)病毒序列驗證 將含靶標(biāo)病毒序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，提取質(zhì)粒送上海Invotrizen公司測序鑒定，經(jīng)軟件比對靶標(biāo)病毒序列與設(shè)計的序列一致，見圖1。

2.2 檢測體系特異性 一種病毒模板，僅與相應(yīng)目標(biāo)微球探針產(chǎn)生特異性熒光信號，與其他微球探針及空白對照檢測到的熒光強度值具顯著差異(P均＜0.01，表2)。

表2 檢測體系的特異性驗證結(jié)果

2.3 檢測體系靈敏度 靶標(biāo)病毒按不同濃度梯度提取RNA，Tem-PCR檢測下限均可達(dá)10拷貝/μl(表3)，具有較高的靈敏度。

圖1 四種靶標(biāo)病毒核酸測序峰圖

3 討論

呼吸道病毒是最常見的引起急性呼吸道感染的病原體之一，不僅可以引起多種嚴(yán)重的并發(fā)癥，其最大的危害是具有潛在引發(fā)局部范圍甚至世界大流行的可能，是目前人類面臨的全球性公共衛(wèi)生問題［5］。由于這些病毒感染導(dǎo)致的臨床癥狀相似，病原學(xué)復(fù)雜，并且新的致病性病毒還在不斷地被發(fā)現(xiàn)，給臨床疾病診斷和治療造成極大的困難，如1997年在香港肆虐的禽流感、2003年SARS的爆發(fā)以及2009年甲型H1N1流感在世界范圍的流行，均提示及時與準(zhǔn)確地快速鑒別病原體，對預(yù)防疾病的傳播和患者的診斷治療至關(guān)重要。

表3 檢測體系靈敏度試驗結(jié)果(x ± s，n=3)

引起急性呼吸道感染的病毒傳統(tǒng)的實驗室診斷方法主要有病毒分離、抗原抗體分析及病毒基因檢測等，這些方法耗時耗力;針對某些病毒如人鼻病毒、人冠狀病毒、副流感病毒等進(jìn)行細(xì)胞分離培養(yǎng)也較困難，還常出現(xiàn)具有典型臨床癥狀和流行病證據(jù)但標(biāo)本檢測結(jié)果為陰性的情況，不利于早期診斷和疫情的應(yīng)急處理。另外，由于病毒合并感染現(xiàn)象普遍存在，而在細(xì)胞培養(yǎng)中一種病毒復(fù)制可能會抑制或掩蓋另一種病毒的復(fù)制，因此細(xì)胞培養(yǎng)方法難以檢出標(biāo)本中可能存在的病毒合并感染，對那些預(yù)后較差的合并感染的早期診斷尤為不利［6］。血清學(xué)方法快速，在較短的時間內(nèi)就可以獲得檢測結(jié)果，但它往往需要病毒感染人體一段時間后才能檢測，并且需要已知的特定抗原或抗體，而造成呼吸道感染的病毒有幾百種，目前市場尚不能滿足診斷要求［7-8］。隨著微生物基因組計劃的進(jìn)展，許多病毒的基因組序列已被破解，已有用 RT-PCR、real-time PCR、nested-PCR 等［9-13］技術(shù)對病毒進(jìn)行快速診斷的相關(guān)報道。但這些方法通常一次只能從標(biāo)本中檢驗出一種病毒，在不明確病毒感染的情況下，這無異于大海撈針。雖然有人采用多重PCR方法對幾種病毒進(jìn)行同時檢測，但往往因為反應(yīng)體系中需要添加更多的擴增引物而導(dǎo)致PCR靈敏度和特異性下降，而且每條不同的靶序列都具有各自的最佳擴增條件，很難將其統(tǒng)一。本研究采用獨特設(shè)計的Tem-PCR擴增技術(shù)，利用標(biāo)準(zhǔn)化高通量液相芯片檢測系統(tǒng)，實現(xiàn)了4種常見呼吸道病毒基因的快速檢測。

該系統(tǒng)采用熒光標(biāo)記通用引物和特異性嵌合引物相結(jié)合建立的多重聚合酶鏈反應(yīng)體系，先由特異引物和嵌合引物的特異性序列分別結(jié)合到cDNA模板啟動PCR反應(yīng)，數(shù)個反應(yīng)循環(huán)后，分別擴增出上下游通用引物的互補序列;反應(yīng)體系中熒光標(biāo)記通用引物的濃度是特異引物和嵌合引物濃度的2.5～40倍，占主導(dǎo)地位的熒光標(biāo)記通用引物與其互補序列結(jié)合引發(fā)后續(xù)指數(shù)擴增。液相芯片技術(shù)(又稱流式熒光技術(shù))是建立在基因芯片技術(shù)上的一項在液相體系中完成探針與目的基因雜交新技術(shù)，它有機地整合了編碼微球、激光技術(shù)、應(yīng)用流體學(xué)、數(shù)字信號處理器和計算機運用等技術(shù)，具有高通量、高速度、低成本、靈敏度高、重復(fù)性好、線性范圍廣等優(yōu)點［14-16］，通過對顏色編碼的微球表面進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾，使之與病毒的特異捕獲探針形成特異的共價結(jié)合。在雜交懸浮體系中，標(biāo)記的PCR產(chǎn)物被結(jié)合有微球的探針捕獲，再經(jīng)過一套微流體系統(tǒng)檢測裝置，紅色激光激發(fā)微球本身的熒光，用于鑒別微球的種類，識別病毒;綠色激光激發(fā)報告分子結(jié)合的熒光，通過檢測熒光的強度對被測物質(zhì)進(jìn)行定量分析。

本研究分析了該系統(tǒng)檢測4種常見呼吸道病毒的特異性和敏感性，數(shù)據(jù)表明該檢測體系具有很好的特異性和較高的靈敏度(可達(dá)10拷貝/μl)，可以靈敏、快速地檢測與呼吸道病相關(guān)的4種常見呼吸道病毒，以實現(xiàn)臨床快速診斷、預(yù)防院內(nèi)感染，為控制大規(guī)模疫情暴發(fā)提供實驗室依據(jù)。但本檢測體系使用的液相芯片技術(shù)比較靈敏，有可能存在污染問題，因此需要對操作進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。另外由于RNA模板容易降解，應(yīng)避免樣本反復(fù)凍融造成假陰性結(jié)果。最后由于病毒各型保守區(qū)核苷酸序列存在不同程度變異，因此該體系還有待于大量臨床樣本的驗證和進(jìn)一步優(yōu)化。

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