陳雅慧 李寶莉 符兆英 高 楓 朱 梅 (延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 76000)

學(xué)習(xí)記憶是大腦最基本也是最重要的高級(jí)神經(jīng)功能，即是認(rèn)知活動(dòng)的組成部分，也是重要的智力因素。學(xué)習(xí)主要是指人或動(dòng)物通過(guò)神經(jīng)系統(tǒng)接受外界環(huán)境信息而影響自身行為的過(guò)程;記憶是指獲得的信息或經(jīng)驗(yàn)在腦內(nèi)貯存和提取再現(xiàn)的神經(jīng)活動(dòng)過(guò)程〔1〕。酸棗仁、梔子配伍成藥對(duì)制成復(fù)方酸棗仁油梔子油，觀察其促學(xué)習(xí)記憶作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，雌雄不限，陜醫(yī)動(dòng)字第08-004，二級(jí)合格動(dòng)物，體重200～250 g，由西安第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品儀器 酸棗仁油、梔子油由超臨界CO2萃取;復(fù)方酸棗仁梔子油膠囊由酸棗仁油與梔子油按2∶1混合而成制成軟膠囊;腦復(fù)康利君制藥廠，批號(hào):050318，與生理鹽水配成0.1%水溶液備用;一氧化氮(NO)測(cè)試盒、乙酰膽堿酯酶(AchE)測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào):200808150。Morris水迷宮由成都泰盟醫(yī)藥設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組 將動(dòng)物隨機(jī)分為五組，每組10只，分別給生理鹽水組(3 mg/kg)和腦復(fù)組(3 ml/kg)，復(fù)方酸棗仁油梔子油大劑量組(2.8 ml/kg)、中劑量組(1.4 ml/kg)、小劑量組(0.7 ml/kg)，均經(jīng)灌胃給藥，各組小鼠每天上午9:00給藥1次，連續(xù)給藥15 d。保持室溫20℃ ～25℃，自由飲水和攝食。

1.3.2 Morris水迷宮檢測(cè) 第16天各組大鼠開(kāi)始分別進(jìn)行Morris水迷宮檢測(cè)，連續(xù)6 d。水迷宮測(cè)試主要包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)大鼠對(duì)水迷宮學(xué)習(xí)和記憶的能力。Morris水迷宮為一圓形水池，直徑120 cm，高50 cm，水深30 cm，水溫控制在22～24℃。池壁標(biāo)明4個(gè)入水點(diǎn)，由此將水池分為4個(gè)象限，任選其中一個(gè)象限，正中放置一個(gè)直徑15 cm，高30 cm的平臺(tái)。計(jì)算機(jī)可以自動(dòng)跟蹤并記錄下大鼠游泳軌跡，當(dāng)設(shè)定的訓(xùn)練時(shí)間已到或大鼠已爬上平臺(tái)，計(jì)算機(jī)停止跟蹤，軟件自動(dòng)計(jì)算出大鼠在水池中所游過(guò)的路徑長(zhǎng)度，找到平臺(tái)所需的時(shí)間 (即潛伏期)和游泳速度等指標(biāo)。大鼠在訓(xùn)練的前1 d，在池中沒(méi)有可逃離的暗藏平臺(tái)時(shí)自由游泳180 s，以適應(yīng)水溫和環(huán)境。訓(xùn)練時(shí)池中被白色泡沫顆粒覆蓋。每天將實(shí)驗(yàn)大鼠按東、南、西、北四個(gè)入水點(diǎn)依次放入水池中，如果大鼠在水中游泳一段時(shí)間爬上平臺(tái)，并在站臺(tái)上停留時(shí)間超過(guò)3 s，則認(rèn)為大鼠找到平臺(tái)，同時(shí)記錄尋找平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)，如果120 s仍未找到平臺(tái)，則人為引導(dǎo)大鼠到達(dá)平臺(tái)，并停留60 s，本次成績(jī)記作120 s。Morris水迷宮測(cè)試每天一次，共訓(xùn)練5 d，實(shí)驗(yàn)第6天將平臺(tái)撤走，進(jìn)行大鼠120 s內(nèi)穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)測(cè)試，用空間探索實(shí)驗(yàn)，用于測(cè)試大鼠學(xué)會(huì)尋找平臺(tái)之后對(duì)平臺(tái)空間位置的記憶能力。水迷宮訓(xùn)練及測(cè)試時(shí)，保持周圍環(huán)境參照物的相對(duì)固定，避免人員的隨意走動(dòng)。

1.3.3 AchE活性和NO含量的測(cè)定 末次測(cè)試結(jié)束后大鼠直接斷頭處死，冰盤(pán)上快速取腦，將右側(cè)腦組織用冰生理鹽水沖洗，分離右側(cè)海馬，加入預(yù)冷的生理鹽水，用勻漿器按1∶9的比例制成10%的組織勻漿，于4℃ 在3 000 r/min離心10 min。提取上清液－20℃凍存待測(cè)。檢測(cè)方法為比色法，嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書(shū)操作。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方酸棗仁油梔子油對(duì)大鼠定位航行能力的影響 隨著訓(xùn)練次數(shù)增加各組大鼠尋找平臺(tái)的潛伏期明顯減少，腦復(fù)康組和小劑量組尤為明顯見(jiàn)表1。第16天各組的潛伏期相比差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。從第17天各組大鼠尋找平臺(tái)的潛伏期開(kāi)始逐漸縮短。在第18天，腦復(fù)康組和大、中、小劑量組的潛伏期明顯較正常對(duì)照組縮短(P＜0.05)。第19、20天腦復(fù)康組和大、中、小劑量組的潛伏期明顯較正常對(duì)照組縮短(P＜0.05)。

2.2 復(fù)方酸棗仁油梔子油對(duì)大鼠空間搜索試驗(yàn)結(jié)果的影響Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)在第20天水迷宮訓(xùn)練后的24 h(第21天)進(jìn)行，可以反映海馬的長(zhǎng)期記憶能力。復(fù)方酸棗仁油梔子油對(duì)大鼠空間搜索試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表2，復(fù)方酸棗仁油梔子油大鼠在平臺(tái)所在象限游泳時(shí)間長(zhǎng)于對(duì)照組，平臺(tái)所在象限游泳距離占總距離百分比明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)，而且復(fù)方酸棗仁油梔子油各組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。復(fù)方酸棗仁油梔子油大鼠在平臺(tái)所在象限游泳時(shí)間、平臺(tái)所在象限游泳距離占總距離百分與腦復(fù)康組比較，無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

表1 各組大鼠尋找隱匿平臺(tái)的潛伏期(± s，s，n=10)

表1 各組大鼠尋找隱匿平臺(tái)的潛伏期(± s，s，n=10)

與生理鹽水組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 第16天 第17天 第18天 第19天 第20天生理鹽水組 94.50±40.01 85.41±42.02 60.05±38.03 59.33±40.08 57.65±48.28腦復(fù)康組 90.06±43.30 48.24±42.261) 41.15±44.141) 36.51±31.361) 20.67±19.071)小劑量組 88.06±33.53 44.33±39.061) 25.13±23.122) 38.96±22.172) 21.15±17.362)中劑量組 90.15±36.54 64.74±48.50 44.17±40.121) 33.70±22.961) 23.52±16.182)大劑量組 91.14±36.09 68.88±36.94 38.53±33.202) 41.53±31.232) 26.56±21.262)

2.3 對(duì)大鼠腦中AchE和 NO含量的影響 生理鹽水組大鼠海馬組織中AchE的含量較復(fù)方酸棗仁油梔子油組大鼠AchE的含量均明顯升高(P＜0.05);生理鹽水組大鼠海馬組織中NO的含量較復(fù)方酸棗仁油梔子油組大鼠腦中NO的含量降低(P＜0.05)。復(fù)方酸棗仁油梔子油組大鼠腦中AchE和NO的含量與腦復(fù)康組比較，無(wú)明顯差異(P＞0.05)。見(jiàn)表3。

表2 Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果(± s，n=10)

表2 Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果(± s，n=10)

與生理鹽水組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 穿越平臺(tái)次數(shù) 平臺(tái)所在象限游泳距離占總路徑(%)平臺(tái)所在象限游泳時(shí)間(s)生理鹽水組3.61±2.41 25.83±9.56 28.48±9.64腦復(fù)康組 3.75±2.71 36.67±7.851) 31.89±13.66小劑量組 4.19±2.871) 41.09±11.321) 30.39±13.681)中劑量組 3.95±3.13 39.49±16.511) 29.93±10.49大劑量組 5.85±1.151) 44.10±6.752) 33.46±10.311)

表3 復(fù)方酸棗仁油梔子油對(duì)大鼠腦中AchE和NO的含量(± s，n=10)

表3 復(fù)方酸棗仁油梔子油對(duì)大鼠腦中AchE和NO的含量(± s，n=10)

與生理鹽水組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 AhE(U/mg) NO(μmol/mg)生理鹽水組0.94±0.61 0.99±0.30腦復(fù)康組 0.85±0.42 1.24±0.261)小劑量組 0.60±0.381) 1.47±0.141)中劑量組 0.59±0.401) 1.36.51±0.361)大劑量組 0.57±0.281) 1.67±0.071)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明復(fù)方酸棗仁油梔子油可以增強(qiáng)大鼠的空間記憶能力，其增強(qiáng)記憶的作用可能與酸棗仁油、梔子油含有多種不飽和脂肪酸有關(guān)。該膠囊主要有超臨界CO2萃取的酸棗仁油、梔子油的組成，主要成分為不飽和脂肪酸占84.1%，且油酸和亞油酸為82%〔1〕。油酸可在體內(nèi)酰化生成油酰胺，已知油酰胺具有影響學(xué)習(xí)記憶的作用〔2〕。亞油酸在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化成亞麻酸、花生四烯酸等。花生四烯酸是人體中含量最高、分布最廣的一種多不飽和脂肪酸。在維持膜的物理特性和功能方面起著非常重要的作用。花生四烯酸還參與神經(jīng)內(nèi)分泌，調(diào)節(jié)多種激素和神經(jīng)肽如加壓素的分泌?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)花生四烯酸的代謝產(chǎn)物—加壓素可提高長(zhǎng)時(shí)學(xué)習(xí)記憶功能〔3，4〕。

已有研究認(rèn)為，Ach為促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)遞質(zhì)，中樞膽堿能系統(tǒng)與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系密切。ACh是海馬的主要神經(jīng)遞質(zhì)，海馬主要與空間記憶有關(guān)，尤其在空間工作記憶的獲得、儲(chǔ)存和提取中發(fā)揮重要作用〔5〕。研究認(rèn)為NO作為氣體神經(jīng)遞質(zhì)，它也參與空間記憶并可以鞏固記憶〔6〕。本實(shí)驗(yàn)證明，復(fù)方酸棗仁油梔子油可以減少大鼠海馬組織中AchE的活性，增加NO的含量。降低AchE的活性意味著Ach的滅活減少，反而增加大腦組織中Ach的水平，在大腦記憶和長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)中Ach和NO中起到一定作用，是鞏固記憶的一個(gè)關(guān)鍵的組分。目前尚不清楚復(fù)方酸棗仁油梔子油促學(xué)習(xí)記憶作用的作用機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。

1 張正祥，李寶莉，陳雅慧，等.復(fù)方酸棗仁油梔子油軟膠囊脂肪酸成份測(cè)定〔J〕.陜西醫(yī)學(xué)，2009;38(7):792-3.

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