馬曉薇 羅永艾 (重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院呼吸內科，重慶 400016)

急性肺損傷(ALI)是由多種病因引起的肺泡-毛細血管膜損傷，并伴有肺內大量分流及嚴重低氧血癥的臨床綜合征〔1〕。目前研究認為其死亡率高的原因與診斷較晚及缺乏新的治療方法有關。最新研究表明〔2〕，ALI是一種失控的炎癥反應，以肺血管內皮細胞(EC)及肺泡上皮廣泛損傷為病理特征，中性粒細胞(PMN)于肺內大量羈留是導致上述損傷的關鍵，并且肺血管內皮細胞損傷在ALI的早期及其發(fā)展變化中常伴隨著內皮細胞的廣泛激活〔3〕。已有研究顯示，血管緊張素轉化酶抑制劑〔4〕和?；撬帷?〕對ALI均有保護作用。本研究通過建立 ALI大鼠的動物模型，觀察ALI大鼠內皮活化和損傷的情況以及?；撬岷虯CEI干預后急性肺損傷大鼠內皮細胞的變化情況，探討血管內皮活化和損傷在ALI中的發(fā)生發(fā)展機制，并觀察?；撬崧摵螦CEI可能的肺損傷保護作用。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料 健康雄性清潔級SD成年大鼠130只(體重160±20)g(寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心提供);脂多糖(L2880，Ecolia O55，B5)，購自 Sigma公司;卡托普利原料藥(常州制藥廠有限公司饋贈);牛磺酸原料藥:購自Sigma公司;可溶性細胞間黏附分子-1(sICAM-1)、內皮素-1(ET-1)、血管性血友病因子(vWF)試劑盒購自為民生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 130只大鼠，隨機分為5組，正常對照組(n=10)，脂多糖組，牛磺酸組，卡托普利組，?；撬岷涂ㄍ衅绽M，每組30只，分為5個時間點。脂多糖組:腹腔注射脂多糖0.5 mg/kg，預激12 h，腹腔注射氯胺酮75 mg/kg麻醉后，給予頸靜脈置管注射脂多糖5 mg/kg，建立ALI模型。正常對照給予等量生理鹽水。?；撬峤M:脂多糖預激后12 h后，同上法麻醉，腹腔注射?；撬?0 mg/kg，頸內靜脈置管注射脂多糖5 mg/kg，3、6、9、12、24 h 時間點采集標本?？ㄍ衅绽M:脂多糖預激后12 h后，同上法麻醉，腹腔注射卡托普利1.25 mg/kg，頸內靜脈置管注射脂多糖 5 mg/kg，3、6、9、12、24 h 時間點采集標本;?；撬岷涂ㄍ衅绽M:脂多糖預激后12 h后，同上法麻醉，腹腔注射?；撬?0 mg/kg和卡托普利1.25 mg/kg，頸內靜脈置管注射脂多糖 5 mg/kg，3、6、9、12、24 h 時間點采集標本。

1.2.2 標本采集 心臟采血 2 ml，EDTAK2管抗凝，3 000 r/min離心，留取血漿，-80℃低溫冰箱保存待檢。同時放血處死動物，暴露頸部，氣管切開置入插管，結扎右肺，右上肺葉10%中性緩沖甲醛液組織固定后石蠟包埋，切片，HE染色。左肺經氣管插管，4℃冰鹽水1.5 ml肺泡灌洗，反復回抽3次，留取肺泡灌洗液，3 000 r/min，20 min離心，取上清液，-80℃低溫冰箱保存待檢。

1.3 檢測指標 右上肺葉10%中性緩沖甲醛溶液組織固定后石蠟包埋，切片，HE染色觀察肺組織。ELISA法分別檢測血漿及肺泡灌洗液中的可溶性細胞間黏附分子-1(sICAM-1)、內皮素-1(ET-1)、血管性血友病因子(vWF):按照試劑盒標準操作步驟進行。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.0軟件進行，多組均數比較采用單因素方差分析，均數兩兩比較采用SNK檢驗。

2 結果

2.1 肺組織病理學變化 光鏡下見正常對照組肺組織結構清晰，肺泡腔及支氣管腔未見炎癥細胞及滲出物。肺損傷組雙肺腫脹，體積增大，重量增加，色澤暗淡，肺表面多見散在出血點，部分肺表面可見片狀實變和梗死灶，支氣管及肺組織切面有白色或淡紅色泡沫狀液體溢出。光鏡下病變廣泛，主要表現為肺組織水腫，小血管周圍水腫套形成，管壁壞死及肺出血，灶性肺萎陷及肺氣腫，較多中性白細胞浸潤及部分單核細胞與嗜酸性細胞浸潤，偶見微血栓及肺透明膜形成，部分小支氣管腔見水腫液和白細胞，個別支氣管黏膜壞死和脫落，可見點、片狀出血，顯示炎癥和輕度肺水腫現象，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔變窄。牛磺酸組、卡托普利組和牛磺酸及卡托普利組上述病理變化改善，尤其以?；撬峒翱ㄍ衅绽M上述病理變化改善明顯。見圖1～圖5。

圖1 正常對照組肺組織結構(HE，×200)

圖2 肺損傷組肺組織病理學變化(HE，×200)

2.2 各組血漿、肺灌注液中sICAM-1水平 血漿中sICAM-1在肺損傷組中所有時間點均較正常值升高，尤以3，6，9，12 h點明顯(P＜0.01)。其余各治療組均較肺損傷組下降，但仍較正常值略高(P＜0.05)。肺泡灌洗液中sICAM-1在肺損傷組較正常對照組明顯升高，尤以3，6 h點明顯(P＜0.01)。?；撬峤M、卡托普利3，6 h組均較肺損傷組有所下降，并略高于正常對照組，在9、12、24 h點逐漸恢復正常。肺灌洗液中sICAM-1牛磺酸加卡托普利組較肺損傷組下降明顯(P＜0.05)，見表1。

2.3 各組大鼠血漿肺灌洗液ET-1水平 血漿中ET-1肺損傷組在3，6，9，12 h時間點較正常對照組升高，而在24 h升高不明顯，各治療組較肺損傷組略有降低。肺泡灌洗液中ET-1肺損傷組較正常對照組有升高，各治療組在不同的時間點較損傷組下降，見表2。

2.4 各組大鼠血漿、肺灌洗液vWF水平 血漿中vWF肺損傷組各時間點均較正常對照組升高，各治療組在不同的時間點較肺損傷組降低(均P＜0.01)，但仍較正常對照組略高;肺泡灌洗液中肺損傷組各時間點均較正常對照組升高。各治療組在不同的時間點較損傷組下降，接近正常對照組。見表3。

表1 各組大鼠血及肺灌洗液中sICAM-1水平( s，ng/L)

表1 各組大鼠血及肺灌洗液中sICAM-1水平( s，ng/L)

與正常對照組比較:1)P＜0.01，與肺損傷組比較:2)P＜0.05，下表同

2 50.09±1.42血漿 215.93±5.23 215.93±5.23 215.93±7.77 215.93±5.23 215.93±5.23肺損傷組 6 肺灌洗液 81.28±18.171) 72.41±5.471) 63.79±6.3011) 67.82±1.901) 65.54±6.241)血漿 351.36±87.161) 335.97±87.161) 293.24±6.251) 281.3±17.491) 404.83±57.371)牛磺酸組 6 肺灌洗液 65.55±8.812) 44.43±1.412) 47.67±0.942) 54.73±5.122) 61.42±11.402)血漿 305.47±76.552) 255.54±21.452) 231.17±19.022) 263.26±43.062) 280.98±39.612)卡托普利組 6 肺灌洗液 52.26±2.162) 60.94±3.072) 59.94±9.092) 49.60±0.612) 48.23±3.302)血漿 267.33±67.192) 312.22±44.652) 274.89±35.282) 226.05±8.322) 299.38±90.292)?；撬?卡托普利組 6 肺灌洗液 65.47±0.792) 64.86±10.272) 58.51±6.042) 54.48±12.592) 51.35±2.892)血漿 287.28±88.432) 266.17±54.402) 213.04±33.882) 295.24±62.722) 281.00±43.632)3 h 6 h 9 h 12 h 24 h正常對照組 2 肺灌洗液 50.09±1.42 50.09±1.42 50.09±1.42 50.09±1.4組別 n

表2 各組大鼠血漿、肺灌洗液中ET-1水平(s，μg/L)

表2 各組大鼠血漿、肺灌洗液中ET-1水平(s，μg/L)

6 16.40±0.36血漿 80.18±1.04 80.18±1.04 80.18±1.04 80.18±1.04 80.18±1.04肺損傷組 6 肺灌洗液 18.05±0.831) 17.66±0.651) 17.03±1.651) 17.31±1.131) 17.16±0.26血漿 87.71±0.771) 86.26±0.541) 84.79±4.531) 88.64±1.501) 76.65±2.82?；撬峤M 6 肺灌洗液 18.22±0.632) 14.66±0.252) 15.62±0.522) 15.52±1.432) 15.77±0.232)血漿 75.00±0.54 80.93±5.24 80.89±2.01 75.42±3.41 67.06±18.38卡托普利組 6 肺灌洗液 17.38±0.272) 16.62±4.492) 16.56±1.072) 16.18±0.212) 15.75±1.252)血漿 77.80±1.08 85.25±2.75 80.19±5.79 78.54±1.96 72.99±3.03?；撬?卡托普利組 6 肺灌洗液 17.24±0.132) 16.42±0.182) 16.75±0.342) 16.04±0.972) 15.01±0.192)血漿 84.89±3.90 82.61±3.80 81.06±4.02 81.73±2.2 3 h 6 h 9 h 12 h 24 h正常對照組 2 肺灌洗液 16.40±0.36 16.40±0.36 16.40±0.36 16.40±0.3組別 n 9 80.28±0.76

表3 各組大鼠血漿、肺灌洗液中vWF水平( s，ng/L)

表3 各組大鼠血漿、肺灌洗液中vWF水平( s，ng/L)

±1.82 443.73±1.82血漿 2 305.10±97.01 2 305.10±97.01 2 305.10±97.01 2 305.10±97.01 2 305.10±97.01 LPS組 6 肺灌洗液 765.60±1.541) 697.48±1.341) 687.04±1.8291) 651.48±3.981) 586.29±3.7221)血漿 4 584.40±200.101) 4 950.10±2.941) 4 731.60±3.721) 4 110.10±2.801) 3 511.10±100.521)?；撬峤M 6 肺灌洗液 553.64±125.982) 569.24±38.932) 582.66±34.732) 607.57±63.442) 557.77±20.842)血漿 3 450.90±229.072)3 493.90±151.872)2 924.60±222.882)3 269.80±221.822)2 926.00±387.862)卡托普利組 6 肺灌洗液 705.00±1.652) 623.03±63.792) 642.95±71.942) 576.46±84.022) 538.32±27.042)血漿 2 332.00±257.392)3 496.50±61.042)3 584.30±519.342)3 316.40±173.072)2 883.40±498.112)?；撬?卡托普利組 6 肺灌洗液 636.11±96.362) 592.01±12.772) 668.09±289.232) 628.10±72.482) 531.88±75.922)血漿 3 062.00±279.302)3 996.60±297.342)2 898.70±100.802)4 295.00±988.342)2 835.30±107.302)3 h 6 h 9 h 12 h 24 h正常對照組 2 肺灌洗液 443.70±1.82 443.73±1.82 443.73±1.82 443.73組別 n

圖3 ?；撬峤M肺組織病理學變化(HE，×200)

圖4 卡托普利組肺組織病理學變化(HE，×200)

圖5 牛磺酸和卡托普利組肺組織病理學變化(HE，×200)

3 討論

ALI的發(fā)病機制復雜，涉及環(huán)節(jié)多，受損的靶細胞多，雖然目前相應治療手段已取得了一些進展，但發(fā)病率和死亡率仍較高，病死率是30% ～40%〔6〕。炎癥反應失控是其中的主要原因，而其導致的彌漫性肺泡損傷是疾病的主要病理特征。目前真正用于臨床治療的有效手段只有小潮氣量通氣，因而ALI的死亡率居高不下。血管內皮細胞是覆蓋于血管內側面的單層扁平上皮細胞，除對各種大分子物質和血細胞成分進入周圍組織起選擇性通透屏障作用外，還具有重要的內分泌功能，在調節(jié)序貫舒縮狀態(tài)及通透性、對抗血小板聚集、維持血管壁完整方面均有重要的意義〔7〕。本研究顯示在ALI時，肺血管滲漏增加;其次，在ALI時，內皮細胞活化的細胞因子即sICAM-1、ET-1和vWF在血漿及肺泡灌洗液中均升高，隨著不同的時間點而不同，在3、6、9 h這三個時間點較為明顯，在12、24 h這兩個時間點升高的值逐漸下降接近正常。因此，在ALI早期，存在肺血管內皮細胞活化和損傷。如果針對這一環(huán)節(jié)進行治療，將會對ALI具有保護作用。

?；撬嵬ㄟ^其抗氧化作用，調節(jié)細胞內鈣離子的流動，阻止人內皮細胞功能喪失和細胞死亡，同時還可通過降低白細胞和血管內皮細胞之間的相互作用來阻止白介素-2誘導的肺組織損傷。此外，?；撬峥娠@著減輕ALI時PMN的聚集，其機制可能與?；撬嶙鳛榭寡趸瘎┮砸种芅F-κB的活化有關〔8〕。本研究?；撬峥赏ㄟ^減輕活化的中性粒細胞引起的內皮損傷以及調節(jié)細胞內鈣離子流量來防止內皮細胞功能障礙，增加中性粒細胞活力，在阻止進一步的肺損傷中起到一定的治療作用〔9〕。文獻報道，?；撬嶂委熀罂梢詼p輕內毒素引起的細胞形態(tài)和生化方面的改變，因此?；撬峋哂袃仍诘目寡缀涂寡趸饔茫梢宰柚笰LI的進一步惡化而起到治療作用〔4〕。而本實驗也驗證了?；撬釋LI有保護作用，可以降低內皮細胞的損傷和活化。

血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)長期應用于高血壓的治療，在1996年被肯定對血管內皮功能障礙具有改善作用〔10〕。本研究提示血管緊張素轉化酶抑制劑對ALI時的內皮細胞活化和損傷有保護作用，其可能的作用機制是通過抑制血管內皮細胞合成血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和ET-1的生成，增加緩激肽的濃度以及降低AngⅡ介導的超氧陰離子的產生，從而減少NO的分解;同時，ACEI可降低內皮細胞的凋亡水平，從而緩解肺血管內皮細胞功能的障礙，改善內皮功能，達到肺保護的作用。此外，ACEI藥物如卡托普利抗氧化損傷作用也被大多數學者認同，Ghazi-Khansari等〔11〕研究發(fā)現，卡托普利是較強的氧自由基清除劑，此作用與其結構上的巰基(-SH)作用有關。巰基具有抗氧化或吞噬氧自由基的功能，類似于內源性氧自由基捕捉劑谷胱甘肽，從而具有抑制氧化應激的作用。

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