王鈺瑩 方 寧 陳代雄 余麗梅 劉祖林 萬 雪

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院貴州省細胞工程重點實驗室，貴州 遵義 563003)

成體干細胞(SSC)具有一定的發(fā)育潛能，在適當?shù)臈l件下可分化成特化的組織細胞，而且來源較廣，可體外擴增，不牽涉?zhèn)惱韺W問題，因而在再生醫(yī)學領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。人羊膜間充質(zhì)干細胞(hAD-MSCs)也是一類典型的SSC，它具有易于體外擴增，無免疫原性、多分化潛能等優(yōu)點，可以成為細胞移植治療缺血性心肌病的一種有前途的新細胞來源〔1～4〕。移植途徑是影響細胞移植治療效果和安全性的重要因素，在動物實驗和臨床試驗中采用的細胞移植途徑包括心肌內(nèi)注射、冠狀動脈內(nèi)注射、冠狀靜脈竇移植等。而經(jīng)靜脈內(nèi)移植，由于可以反復(fù)、多次、大量進行無創(chuàng)的治療，是最具有應(yīng)用前景的治療方法。本實驗旨在觀察靜脈移植hAD-MSCs到心肌梗死 (MI)大鼠體內(nèi)后在重要臟器的分布以及對心功能的影響，探討靜脈移植hAD-MSCs治療MI的可行性和安全性。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠，體重(200±20)g，購自第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院動物實驗中心〔許可證號:SCXK(渝)2007-0005〕。LG-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司，5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)、鼠抗人Brdu抗體、α-輔肌動蛋白抗體購自Sigma公司，連接蛋白-43(CX-43)抗體、羊抗鼠IgG-FITC、羊抗兔Ig-Texas Red購自Santa Cruz公司，鼠抗人細胞核特異性抗體MAB1281、結(jié)蛋白抗體購自Chemcion公司，免疫組化單染試劑盒(EnVisionTMDetection Systems Peroxidase/DAB，兔/鼠)購自Gene Tech公司，用于流式細胞儀檢測的全部熒光標記抗體均購自BD公司，彩色多普勒超聲心動圖儀為德國ACUSON公司產(chǎn)品(型號Sequoia512)。

1.2 hAD-MSCs分離、培養(yǎng)、鑒定及標記 經(jīng)知情同意后，采自足月剖宮產(chǎn)分娩胎盤，剝離羊膜，D-Hank液反復(fù)沖洗，剪碎羊膜，0.02%EDTA-0.05%胰蛋白酶37℃消化20 min，反復(fù)3次，棄上清液，去除羊膜上皮細胞。0.75 mg/mlⅡ型膠原酶，0.075 mg/ml DNaseⅠ，37℃，200 r/min 旋轉(zhuǎn)消化 2 h，300 目不銹鋼網(wǎng)過濾，收集細胞濾液，1 500 r/min離心10 min，棄上清液，細胞重新懸浮于含10%FBS的 L-DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。細胞增殖達80%融合時細胞傳代，取第3代細胞用流式細胞儀檢測細胞表面抗原 CD44、CD73、CD90、CD 105、CD45、CD34、CD11b、CD19 及 HLA-DR 的表達，免疫細胞化學染色檢測波形蛋白。取第3代細胞以5×105/cm2細胞密度分別接種，接近50%融合時，加入Brdu(終濃度為10 μg/ml)，孵育48 h，收集Brdu標記的細胞供移植時使用。

1.3 大鼠MI模型的建立及hAD-MSCs移植〔5〕10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔麻醉，氣管插管，在心電監(jiān)護下，左胸第2～3肋間隙開胸，于左心耳下方1～2 mm處用6/0號絲線結(jié)扎左冠狀動脈前降支，心電圖示R波振幅升高，ST段(J點)抬高可確定建模成功。術(shù)后腹腔注射青霉素20 IU/kg連續(xù)7 d。實驗設(shè)模型組、hAD-MSCs移植組和假手術(shù)組各12只。移植組經(jīng)舌下靜脈注入 Brdu標記的 hAD-MSCs懸液0.4 ml(2×106個細胞/只)，模型組和假手術(shù)組分別經(jīng)相同途徑注射等體積無血清培養(yǎng)基。

1.4 心臟功能檢測 分別于制模前，制模后1 w及移植后6 w采用彩色多普勒超聲心動圖儀(15 MHz探頭)檢測左室心功能，檢測時探頭置于大鼠胸前，調(diào)整角度取胸骨旁左室長軸和乳頭肌水平短軸切面。檢測指標包括射血分數(shù)(EF)、左室短軸縮短率(FS)、舒張期左室前壁厚度(LVAWd)、收縮期期左室前壁厚度(LVAWs)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVDs)、左室舒張末期容積(EDV)和左室收縮末期容積(ESV)。每項指標連續(xù)測定3次，取平均值。

1.5 組織學、免疫組化和免疫熒光檢測 心功能測定結(jié)束后處死動物，取心、肝、肺和脾臟組織置于4%多聚甲醛中固定，20%蔗糖溶液脫水，石蠟包埋，按5μm厚度連續(xù)切片，脫蠟水化，心肌組織行HE染色。免疫組化染色:組織切片經(jīng)脫蠟至水，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，DNA變性，山羊血清封閉后，加鼠抗人Brdu單抗，4℃孵育過夜，加兔鼠通用二抗。DAB顯色，顯微鏡下觀察，細胞核呈棕褐色者為Brdu標記陽性細胞。免疫熒光染色:取心臟剝離左心室，經(jīng)OCT包埋后連續(xù)切成5 μm超薄切片，室溫晾干，Triton X-100作用，山羊血清封閉后，加入小鼠抗人細胞核特異性抗體MAB1281與CX-43抗體或α-actinin抗體的混合抗體，4℃孵育過夜，加入FITC標記的羊抗鼠IgG與德克薩斯紅(TR)標記的羊抗兔IgG混合的二抗，37℃避光孵育2 h。甘油封片，熒光顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 hAD-MSCs形態(tài)、表型特征及Brdu標記效果 hAD-MSCs形態(tài)為梭形或多角形，細胞排列緊密，胞體拉伸，呈單層放射狀或漩渦狀生長，增殖迅速。免疫組化染色顯示hAD-MSCs表達波形蛋白，增殖期hAD-MSCs的Brdu標記陽性率達90%以上(圖1)。FCM分析結(jié)果顯示，分離的hAD-MSCs高表達CD44、CD90、CD73 和 CD105，幾乎不表達 CD45、CD34、CD11b、CD19及 HLA-DR(圖2)。

圖1 hAD-MSCs生長形態(tài)及波形蛋白和Brdu標記細胞的免疫組化染色

圖2 hAD-MSCs流式細胞術(shù)表型分析結(jié)果

2.2 心肌組織病理變化 HE染色結(jié)果顯示，模型組MI區(qū)，可見心肌纖維腫脹，心肌細胞核消失，間質(zhì)出血，心肌細胞壞死，伴大量急性炎癥細胞浸潤;hAD-MSCs移植組移植后6 w炎性細胞浸潤明顯減輕，新生毛細血管增多，形成瘢痕組織(圖3)。

2.3 hAD-MSCs經(jīng)靜脈移植后在心、肝、肺和脾臟中的分布細胞移植后6 w的組織切片中可見Brdu標記的陽性細胞，主要分布于MI組織與正常組織的交界區(qū)域，細胞形態(tài)完整，細胞核呈棕褐色，而正常心肌組織未見陽性細胞。hAD-MSCs除可以分布在梗死心肌組織外，肺和脾臟組織中亦可見部分hADMSCs存活，但肝臟中未見hAD-MSCs。見圖4。

2.4 hAD-MSCs在MI大鼠心臟中的定植及分化 移植的hAD-MSCs主要定位于梗死區(qū)及邊緣區(qū)，免疫熒光雙染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)人細胞核抗原與CX-43、α-輔肌動蛋白陽性細胞同時表達，提示移植的hAD-MSCs在MI向心肌細胞分化(圖5)。

2.5 hAD-MSCs經(jīng)靜脈移植后對心功能的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心功能各項指標均發(fā)生異常(均P＜0.05)，表現(xiàn)為明顯的收縮和舒張功能障礙。與模型組比較，移植組心功能各項指標明顯改善，尤其是反映左心室收縮功能的EF、FS和反映左心室前壁厚度的LVAWd和LVAWs，明顯高于模型組(P＜0.01)(圖6)。

圖3 hAD-MSCs移植后MI區(qū)病理變化(×200)

圖4 hAD-MSCs靜脈移植后6 w在MI區(qū)和主要器官中的分布(×200)

圖5 hAD-MSCs移植后6 w在心肌原位表達心肌細胞特異性蛋白

圖6 hAD-MSCs移植后對MI大鼠心功能的影響

3 討論

干細胞移植是近年來心肌損傷修復(fù)研究的一個熱點問題，很多動物實驗和臨床研究均證實，干細胞移植對受損心肌組織的修復(fù)以及心功能改善有積極的作用。通過何種途徑將移植細胞輸送到受損心肌組織內(nèi)也成為眾多學者的研究方向。經(jīng)冠脈內(nèi)、心內(nèi)膜和心外膜直視注射移植細胞雖然移植成功率較高，但都因技術(shù)要求高及具有創(chuàng)傷性，增加了患者的痛苦，臨床應(yīng)用受到限制。Orlic等〔6〕嘗試了經(jīng)靜脈途徑移植干細胞保護梗死心臟，結(jié)果表明靜脈移植方式能有效地改善左心室功能，縮小梗死面積。Nagaya等〔7〕從同源大鼠分離出MSCs，通過靜脈注入移植后，發(fā)現(xiàn)細胞先到達梗死心肌，且表達心肌特異性標記結(jié)蛋白、肌鈣蛋白T、連接蛋白43。本實驗選擇在MI后1 w移植細胞，考慮到MI早期的炎癥性反應(yīng)不利于細胞的存活，而梗死后1 w炎癥反應(yīng)漸于消退，很多細胞因子表達處于高峰期，有利于移植細胞向受損區(qū)域遷移〔8〕。

肺臟是移植細胞最先移行的臟器，Gao等〔9〕靜脈注射MSCs進行骨組織修復(fù)和Fischer等〔10〕靜脈注射MSCs修復(fù)豬MI的研究顯示，由于肺的“首關(guān)效應(yīng)”，移植后大部分細胞被肺血管所“俘獲”，使細胞無法通過而導(dǎo)致大量細胞滯留于肺組織中。本研究表明靜脈移植的hAD-MSCs可以通過血液循環(huán)遷移到MI區(qū)的心肌組織內(nèi)。此外，在脾臟中也可見少量滯留的細胞，這可能是由于移植細胞受到肺循環(huán)中豐富血流不斷沖刷，細胞得以逃逸到其他組織器官中，這些與其他研究結(jié)果一致〔11〕。本研究中肝臟組織未見有細胞存留，這可能與細胞遭受炎癥、免疫等因素影響后出現(xiàn)凋亡或死亡，導(dǎo)致細胞數(shù)量減少而未檢測到。這些結(jié)果表明移植細胞能夠定植于MI區(qū)域及周邊區(qū)域，并分布在重要器官中，說明供體細胞具有向受損心肌組織遷徙特性，且提示細胞通過簡便的靜脈移植途徑治療MI是可行的。

hAD-MSCs經(jīng)靜脈注射后不僅有細胞分布到MI區(qū)域，而且還能夠保護心臟功能，延緩梗死后左心室的重構(gòu)。本實驗研究表明移植hAD-MSCs可在一定程度上抑制MI后心室重構(gòu)，對防止因心室重構(gòu)而導(dǎo)致的心力衰竭具有積極意義。本實驗說明hAD-MSCs移植后可在大鼠MI區(qū)向心肌細胞分化。hAD-MSCs移植可改善MI后心臟功能。即便還沒有證據(jù)證明hAD-MSCs分化成的心肌樣細胞直接參與了心臟的收縮功能，但有一點是可以肯定，即hAD-MSCs抑制MI后心室重構(gòu)是其提高心功能的重要的病理生理學機制。

關(guān)于移植細胞對MI后的心肌修復(fù)的作用機制尚不十分清楚，可能與供體細胞分化成心肌細胞，促進新生血管形成，通過旁分泌作用抑制心肌細胞凋亡或促進殘留心肌細胞再生等因素有關(guān) 。本實驗結(jié)果所顯示的hAD-MSCs對MI的修復(fù)作用是否與其分化成心肌細胞有關(guān)，分化的心肌細胞是否參與了心臟的收縮功能，抑或通過旁分泌作用介導(dǎo)抑制心肌細胞凋亡或促進心肌細胞增生和血管形成，均有待深入研究。

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