魏鳳仙 胡驍飛 張敏紅 李紹鈺 徐 彬藺 萍 孫全友 李 浩

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，鄭州 450002;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100193;3.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南省動物免疫學(xué)重點實驗室，鄭州 450002;4.河南省森林航空消防站，鄭州 450003)

應(yīng)激能影響動物和人體的免疫機能［1-2］。慢性應(yīng)激觸發(fā)機體產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)包括急性自主神經(jīng)功能不全、神經(jīng)內(nèi)分泌激活、血流動力學(xué)改變和引發(fā)炎癥反應(yīng)過程等。細胞因子不僅是調(diào)節(jié)免疫功能的蛋白質(zhì)，也是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間信息交流的重要介質(zhì)。了解相對濕度(relative humidity，RH)和氨氣(NH3)應(yīng)激條件下肉仔雞血清相關(guān)細胞因子的動態(tài)變化，可為改善動物福利、增強機體免疫機能和提高動物的生產(chǎn)成績提供理論依據(jù)。舍內(nèi)環(huán)境應(yīng)激因素中以有害氣體NH3濃度經(jīng)常超標、RH被普遍認識而不被重視最為常見。NH3被認為是肉雞舍里最有害的氣體［3］，腹水癥、胃腸炎、呼吸道疾病都與高濃度的NH3相關(guān)。通常認為RH對肉仔雞的影響是與溫度共同起作用的，但Yahav［4］認為，即使在適宜的環(huán)境溫度(28和32℃)條件下，60% ～65%RH條件下的肉仔雞仍能獲得較多的飼料采食量和增重。Steptoe等［5］對眾多研究人心理應(yīng)激后細胞因子變化的結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果表明血清中白細胞介素1β(IL-1β)和白細胞介素6(IL-6)是應(yīng)激時炎癥反應(yīng)最具代表性的指示物。但也有研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)激不一定引起細胞因子的升高［6］。疫病多發(fā)、新病、混合性疾病增多及傳播快、死亡率高等是當前畜禽養(yǎng)殖場疫病發(fā)生的特點。由于動物抗病性差，輕微的細菌或病毒感染即可能會引起死亡，其主要原因在于動物機體的免疫功能下降，對疾病的敏感性增加［7］。隨著現(xiàn)代肉仔雞早期生長速度的不斷提高，源于環(huán)境與生理等內(nèi)、外應(yīng)激因素對肉仔雞健康狀況和生長性能的影響日漸顯著，雞舍內(nèi)有害氣體(NH3、硫化氫和二氧化碳)濃度及其與RH組合是影響雞舍內(nèi)環(huán)境的主要因素。就目前的有關(guān)研究現(xiàn)狀而言，多數(shù)為評估雞舍單一環(huán)境因素對肉仔雞的影響，多因素組合效應(yīng)研究鮮見報道。在實際生產(chǎn)中，更多的情況是溫度、RH和有害氣體濃度等多種環(huán)境因素交互作用危害雞群健康。應(yīng)激可以引起機體免疫機能的變化，而不同RH和NH3慢性應(yīng)激條件下對肉仔雞血氨及相關(guān)細胞因子影響的研究甚少。本試驗采用智能人工氣候艙控制設(shè)施，利用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法測定機體重要細胞因子的變化，探尋RH和NH3慢性應(yīng)激條件下免疫相關(guān)細胞因子動態(tài)變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及設(shè)計

1.1.1 試驗動物

試驗選擇生長均勻的21日齡健康愛拔益加(AA)雄性肉仔雞288只(雛雞苗購自北京華都肉仔雞公司，普通雞舍飼養(yǎng)至21日齡)，隨機分為6個處理，每個處理6個重復(fù)，每個重復(fù)8只雞，各處理肉仔雞體重差異不顯著(P＞0.05)。

1.1.2 試驗設(shè)計

試驗采用雙因素，2×3因子設(shè)計。處理1:30 mg/kg NH3+35% RH;處理 2:30 mg/kg NH3+60%RH;處理 3:30 mg/kg NH3+85%RH;處理 4:70 mg/kg NH3+35%RH;處理 5:70 mg/kg NH3+60% RH;處理 6:70 mg/kg NH3+85%RH。試驗在人工氣候?qū)嶒炁撏瓿?，試驗?周。

1.2 可程式人工氣候?qū)嶒炁?/h3>

本試驗在動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室可程式人工氣候?qū)嶒炁撨M行。6個處理的試驗肉仔雞分別飼養(yǎng)在6個可程式人工氣候?qū)嶒炁搩?nèi)，試驗期間通過計算機程序設(shè)定分別控制人工氣候?qū)嶒炁搩?nèi)RH和NH3濃度至試驗要求。試驗雞入艙前5 d，用福爾馬林+高錳酸鉀進行熏蒸。各人工氣候?qū)嶒炁搩?nèi)NH3濃度用德國多氣體檢測儀，RH用濕度計，每隔4 h檢測1次，與計算機控制顯示系統(tǒng)校對。其他環(huán)境參數(shù)基本相同，試驗期間各試驗艙內(nèi)溫度為25～26℃。

1.3 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平

試驗采用玉米-豆粕型飼糧，飼糧配方參照NRC(1994)肉仔雞飼養(yǎng)標準配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。各處理飼喂相同基礎(chǔ)飼糧。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.4 飼養(yǎng)管理及免疫

試驗采用3層籠養(yǎng)，試雞自由采食、飲水。24 h人工光照。免疫程序為:7日齡新支二聯(lián)苗滴鼻點眼，14日齡法氏囊飲水免疫，19日齡法氏囊飲水免疫，26日齡新支二聯(lián)苗飲水免疫。

1.5 樣品采集與指標測定

1.5.1 樣品采集與制備

RH和NH3慢性應(yīng)激時間分別以入艙1、2和3周計。分別于入艙1、2和3周末每重復(fù)隨機取1只體重接近平均體重的雞，于清晨空腹，翅靜脈采血10 mL。其中1 mL注入已制備好的抗凝管(抗凝劑為草酸鈉)內(nèi)，迅速搖動，使全血與抗凝劑充分接觸，立即3 000 r/min、4℃離心10 min，收集血漿，并在30 min內(nèi)測定血氨水平。另外9 mL全血注入干凈試管內(nèi)，傾斜靜置，常溫下制備血清。待血清析出后，在4～5℃下以3 000 r/min離心10 min。吸取上清液，分裝置于安瓿管內(nèi)，-20℃冷凍待測。

1.5.2 指標測定

血氨水平采用北京利德曼生化技術(shù)有限公司血氨測定試劑盒測定，加樣和測定過程均在4℃條件下進行。測定方法為谷氨酸脫氫酶兩點法。

細胞因子含量測定:雙抗夾心酶聯(lián)免疫法測定血清中IL-1β、白細胞介素4(IL-4)、IL-6、白細胞介素10(IL-10)4種細胞因子含量，嚴格按試劑盒說明書操作，每樣品做2個復(fù)孔。按繪制的標準曲線，換算出各樣品中相應(yīng)細胞因子的含量(試劑盒購自RapidBio Lab，美國)。

1.6 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)表示為平均值，采用SPSS13.0軟件中的GLM模塊的多因素程序和one-way ANOVA進行統(tǒng)計，以 P＜0.05為顯著水平，0.05≤P＜0.10為存在顯著性趨勢，并進行LSD多重比較，如果存在互作，則對各處理進行Duncan氏法多重比較。

2 結(jié)果

2.1 RH和NH3應(yīng)激對肉仔雞血氨水平的影響

由表2可見，NH3濃度顯著影響各階段血氨水平(P＜0.05)。高NH3濃度組入艙1、2周的血氨水平顯著高于低NH3濃度組(P＜0.05)。RH對入艙1、2周血氨水平影響不顯著(P＞0.05)，而對入艙3周血氨水平影響接近顯著(P=0.052)，且隨RH的增加血氨水平呈上升趨勢。處理6與其他處理(處理5除外)相比，入艙3周血氨水平顯著升高(P＜0.05)。

2.2 RH和NH3應(yīng)激對肉仔雞血清IL-1β、IL-6含量的影響

由表3可見，NH3濃度對血清細胞因子含量有一定影響，入艙1、3周IL-1β含量分別接近顯著(P=0.069)和顯著(P＜0.05);RH有升高血清IL-1β和IL-6含量的趨勢，對入艙3周IL-1β含量影響顯著(P＜0.05)。

處理6入艙1周IL-1β含量顯著高于處理2(P＜0.05)。處理6入艙2周IL-6含量顯著高于處理2(P＜0.05)。處理6入艙3周IL-1β含量顯著高于處理 1、2、5(P ＜0.05)。

隨入艙時間的延長，血清IL-1β和IL-6含量呈上升的趨勢。與入艙1周相比，處理3、4入艙3周血清IL-1β含量顯著升高(P＜0.05)。

2.3 RH和NH3應(yīng)激對肉仔雞血清IL-4、IL-10含量的影響

由表4可見，NH3濃度對入艙1、2周血清IL-4含量影響顯著(P＜0.05)。NH3濃度對入艙1、3周血清IL-10含量影響顯著(P＜0.05)。RH對入艙1周血清 IL-10含量影響顯著(P＜0.05)。85%RH與35%RH和60%RH相比，入艙1周血清IL-10含量顯著升高(P＜0.05)。

處理2入艙1周血清IL-4含量顯著低于處理4、5、6(P ＜0.05)，處理 6 顯著高于處理 2、3(P ＜0.05);處理1入艙2周血清IL-4含量顯著低于處理4、5(P＜0.05);處理6入艙3周血清IL-4含量顯著高于處理1(P＜0.05)。處理6入艙1周血清IL-10含量顯著高于處理1、2、4(P＜0.05);處理6入艙3周血清IL-10含量顯著高于處理1、3、5(P＜0.05)。

隨著入艙時間的延長，處理6血清IL-4、IL-10含量呈現(xiàn)持續(xù)增加趨勢，而其他各處理呈現(xiàn)先增加后降低趨勢。RH和NH3濃度對入艙1周血清IL-4含量互作效應(yīng)接近顯著(P=0.059)，而對入艙3周血清IL-10含量有顯著的互作效應(yīng)(P＜0.05)。

表2 RH和NH3應(yīng)激對肉仔雞血氨水平的影響Table 2 Effects of RH and NH3stress on plasma ammonia level of broilers μmol/L

表3 RH和NH3應(yīng)激對肉仔雞血清IL-1β、IL-6含量的影響Table 3 Effects of RH and NH3stress on the contents of IL-1βand IL-6 in serum of broilers ng/L

表4 RH和NH3應(yīng)激對肉仔雞血清IL-4、IL-10含量的影響Table 4 Effects of RH and NH3stress on the contents of IL-4 and IL-10 in serum of broilers ng/L

3 討論

環(huán)境NH3濃度高是養(yǎng)殖生產(chǎn)中最常遇見的問題［8-10］。環(huán)境NH3濃度對肉仔雞血氨水平有直接影響，宋弋［11］研究表明，血氨水平隨著環(huán)境中NH3濃度的增加而逐漸升高。本研究也得到了相同的結(jié)論，環(huán)境NH3濃度極顯著影響肉仔雞血氨水平，且發(fā)現(xiàn)隨著入艙時間的延長，肉仔雞血氨水平呈上升趨勢。同時，本試驗還發(fā)現(xiàn)隨著環(huán)境RH增加，肉仔雞血氨水平呈上升趨勢?？赡苁怯捎贜H3極易溶于水，高 RH時空氣中溶有更多的NH3，造成更多的NH3被吸入動物機體，這可能解釋了本研究結(jié)果隨RH增加動物機體血氨水平升高的現(xiàn)象。當血氨超過正常水平時，會影響腦神經(jīng)細胞和肌肉細胞的新陳代謝，使家禽出現(xiàn)氨中毒現(xiàn)象，抑制采食中樞。同時，血氨水平升高會加劇機體相關(guān)器官如肝、腦、肌肉等對氨的解毒，而這是一個高度耗能的過程。因此，用于生長和生產(chǎn)的能量相應(yīng)減少，使動物的生長性能受到影響，這能在一定程度上解釋了高NH3濃度降低肉雞生長性能研究結(jié)果［12］的原因。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析顯示，RH和NH3濃度對肉仔雞血氨水平的影響無互作效應(yīng)，但隨著RH的升高，血氨水平有升高的趨勢。

細胞因子是一類主要由免疫細胞和相關(guān)細胞產(chǎn)生的高活性、多功能小分子蛋白質(zhì)或多肽，它與免疫細胞分化發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)有關(guān)。研究表明，應(yīng)激能改變免疫細胞的功能，持續(xù)改變細胞因子的產(chǎn)生［13-15］。促炎細胞因子白細胞介素1(IL-1)、IL-6是主要由單核-巨噬細胞及Th1產(chǎn)生，可提高機體免疫機能，但產(chǎn)生過多又可促進炎癥反應(yīng)，造成組織損傷，是應(yīng)激性損傷的直接介導(dǎo)物。研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧、缺血及應(yīng)激狀態(tài)下，IL-1和IL-6表現(xiàn)為明顯的上行調(diào)節(jié)和持續(xù)的分泌增多［13，16-17］。IL-1 有 IL-1α、IL-1β 和 IL-1γ 3 種活性形式，IL-1β是血漿和組織液中的主要分泌形式。IL-1β還可以協(xié)同其他細胞因子促進B細胞、T細胞活化，而且能誘導(dǎo)其他炎癥產(chǎn)物的生成。慢性應(yīng)激時交感神經(jīng)及腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活導(dǎo)致去甲腎上腺素和平滑肌細胞表達IL-6增加，從而引起IL-6含量升高。本試驗也得到了一致的結(jié)論:高NH3濃度對入艙1、3周肉仔雞血清IL-1β含量影響分別接近顯著和顯著;低濕(35%RH)或高濕(85%RH)有升高肉仔雞血清IL-1β和IL-6含量的趨勢，高濕顯著提高入艙3周IL-1β含量。隨RH和NH3應(yīng)激時間的延長，IL-1β和IL-6表現(xiàn)為持續(xù)分泌增多。

抗炎細胞因子IL-4和IL-10是由Th2細胞產(chǎn)生，為重要的內(nèi)源性抗炎細胞因子，可減輕組織炎癥反應(yīng)。IL-4是由T細胞、肥大細胞、活化的成纖維細胞和嗜堿性粒細胞等產(chǎn)生的一種多功能抗炎癥細胞因子。IL-10又稱細胞因子合成抑制因子，是體內(nèi)重要的抗炎性細胞因子和免疫抑制因子［18］。本試驗中，入艙2周時，各處理雞血清IL-4、IL-10含量呈現(xiàn)增加趨勢，表明肉仔雞隨著RH和NH3應(yīng)激時間的延長，機體組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，刺激產(chǎn)生更多的抗炎性細胞因子IL-4、IL-10以減輕組織炎癥反應(yīng)，與機體處于免疫抑制狀態(tài)時表現(xiàn)為Th2類細胞因子產(chǎn)生方式結(jié)論一致，機體免疫力降低。而入艙3周時，除70 mg/kg NH3+85%RH處理外，其他各處理IL-4和IL-10含量下降，但仍高于入艙1周時IL-4和IL-10含量，表明隨著應(yīng)激時間的延長，機體產(chǎn)生了一定的適應(yīng)不良環(huán)境的能力，對機體的免疫抑制效應(yīng)降低。RH和NH3濃度對入艙1周血清IL-4含量互作效應(yīng)接近顯著，而對入艙3周血清IL-10含量互作效應(yīng)影響顯著。35%RH或85%RH加重了高NH3濃度對機體的不良影響。

有研究報道，各種不同的應(yīng)激因素能誘導(dǎo)IL-1β和IL-6等促炎細胞因子的分泌［13］。也有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠給予心理社會應(yīng)激后，白細胞介素2(IL-2)、IL-6和白細胞介素8(IL-8)含量皆顯著降低［19］。但也有研究認為應(yīng)激不一定引起細胞因子的含量升高［6］。不同研究報道結(jié)論有差異，可能與應(yīng)激刺激的性質(zhì)、強度、持續(xù)時間、應(yīng)激時間的選擇及動物的品種、年齡等有關(guān)。本試驗結(jié)果免疫相關(guān)細胞因子的動態(tài)變化顯示了應(yīng)激對機體免疫功能影響的復(fù)雜性。

4 結(jié)論

①高NH3濃度顯著增加肉仔雞血氨水平;隨RH增加，血氨水平呈上升趨勢。70 mg/kg NH3+85%RH應(yīng)激顯著增加肉仔雞血氨水平。

②禽舍低或高RH及NH3損害了肉仔雞免疫機能。隨著應(yīng)激時間的延長，機體獲得一定的適應(yīng)不良環(huán)境的能力，對機體的免疫抑制效應(yīng)具有降低趨勢，但70 mg/kg NH3+85%RH長時間慢性應(yīng)激對肉仔雞的免疫抑制作用不可緩解。

［1］LAWRENCE D A，KIM D.Central/peripheral nervous system and immune responses［J］.Toxicology，2000，142(3):189-201.

［2］PADGETT D A，GLASER R.How stress influences the immune response［J］.Trends in Immunology，2003，24(8):444-448.

［3］CARLILE F S.Ammonia in poultry houses:a literature review ［J］.World’s Poultry Science Journal，1984，40(2):99-113.

［4］YAHAV S.Relative humidity at moderate ambient temperatures:its effect on male broiler chickens and turkeys［J］.British Poultry Science，2000，41(1):94-100.

［5］STEPTOE A，HAMER M，CHIDA Y.The effects of acute psychological stress on circulating inflammatory factors in humans:a review and meta-analysis［J］.Brain，Behavior and Immunity，2007，21(7):901-912.

［6］MAIER SF，WATKINS L R.Cytokines for psychologists:implications of bidirectional immune-to-brain communication for understanding behavior，mood，and cognition［J］.Psychological Review，1998，105(1):83-107.

［7］WONG C W，SMITH S E，THONG Y H，et al.Effects of exercise stress on various immune functions in horses［J］.American Journal of Veterinary Research，1992，53(8):1414-1417.

［8］LACEY R E，REDWINE J S，PARNELL C B.Particulate matter and ammonia emission factors for tunnelventilated broiler production houses in the southern U.S.［J］.Transactions of the ASAE-American Society of Agricultural，2003，46(4):1203-1214.

［9］ULLMAN J L.Remedial activities to reduce atmospheric pollutants from animal feeding operations［J］.Agricultural Engineering International:The CIGR Ejournal of Scientific Research and Development，2005，7(9):1-40.

［10］MUKHTAR S，ROSE A J，CAPAREDA S C，et al.Assessment of ammonia adsorption onto Teflon and LDPE tubing used in pollutant stream conveyance［J］.Agricultural Engineering International:The CIGR Journal of Scientific Research and Development，2003，5:1-13.

［11］宋弋.氨氣對肉雞的危害及減氨技術(shù)研究［D］.碩士學(xué)位論文.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006:15-16.

［12］WEI F X，XU B，LI SY，et al.The effect of ammonia and humidity in poultry houses on intestinal morphology and function of broilers［J］.Journal of Animal and Veterinary Advances，2012，11(19):3641-3646.

［13］APPELS A，B?R F W，B?R J，et al.Inflammation，depressive symptomtology，and coronary artery disease［J］.Psychosomatic Medicine，2000，62(5):601-605.

［14］STEVENSON L S，MCCULLOUGH K，VINCENT I，et al.Cytokine and C-reactive protein profiles induced by porcine circovirus type 2 experimental infection in 3-week-old piglets［J］.Viral Immunology，2006，19(2):189-195.

［15］MEAGHER M W，JOHNSON R R，YOUNG E E，et al.Interleukin-6 as a mechanism for the adverse effects of social stress on acute Theiler’s virus infection［J］.Brain，Behavior and Immunity，2007，21(8):1083-1095.

［16］HARTMANN G，TSCH?P M，F(xiàn)ISCHER R，et al.High altitude increases circulating interleukin-6，interleukin-1 receptor antagonist and c-reactive protein［J］.Cytokine，2000，12(3):246-252.

［17］KARAKURUM M，SHREENIWAS R，CHEN L，et al.Hypoxic induction of interleukin-8 gene expression in human endothelial cells［J］.Journal of Clinical Investigation，1994，93(4):1564-1570.

［18］MOORE K W，O＇GARRA A，DE MALEFYT R W，et al.Interleukin-10［J］.Annual Review of Immunology，1993，11(1):165-190.

［19］馬文濤，楊來啟，林玉梅，等.應(yīng)激對大鼠血清皮質(zhì)醇及白細胞介素2、6、8水平的影響［J］.中國心理衛(wèi)生雜志，2002，16(1):14-15.