張 殷 高偉忠 但 伶 (重慶醫(yī)科大學附屬大學城醫(yī)院手術(shù)麻醉科，重慶 4033)

急性肺損傷(ALI)作為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的早期階段越來越受到臨床醫(yī)師的廣泛重視，它可產(chǎn)生于肝病及腸道病變、多發(fā)創(chuàng)傷、膿毒癥等多種原因。肝缺血再灌注(IR)是創(chuàng)傷性休克、肝臟外科臨床中常見的病理生理過程，IR不僅會導致肝臟損傷，還可導致遠隔臟器的損傷及功能下降，其中肺臟是最容易受累的臟器之一〔1〕。核因子E2相關(guān)因子(Nrf2)通過與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)相互作用調(diào)節(jié)編碼抗氧化蛋白，是內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激的核心通路〔2〕。研究表明，靜脈麻醉藥丙泊酚可影響多種細胞因子和炎癥反應(yīng)通路，具有抗氧自由基、抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的功能〔3〕及減輕炎癥反應(yīng)的作用〔4〕。丙泊酚能減輕肝IR對肺的損傷作用〔5〕，但其對肝IR所致ALI時轉(zhuǎn)錄因子紅細胞系相關(guān)因子-抗氧化反應(yīng)元件(Nrf2-ARE)通路的影響未見相關(guān)報道。本實驗通過觀察丙泊酚對Nrf2、血紅素加氧酶-1(HO-1)蛋白表達的影響，進一步探討丙泊酚對肝IR損傷所致ALI保護的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康SD大鼠24只購于重慶醫(yī)科大學動物實驗中心，雌雄不限，體重220～250 g。

1.1.2 主要試劑 丙泊酚(批號:JH714，公司:AstraZeneca)，兔抗大鼠Nrf2、兔抗大鼠HO-1多克隆抗體和辣根酶標記山羊抗兔IgG購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，鏈霉親合素-生物素復合物(SABC)免疫組化試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購于武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備和分組 動物被隨機分為三組(n=8):假手術(shù)組(SH組)、肝IR致ALI組(IR組)和丙泊酚組(P組)。大鼠術(shù)前禁食12 h，水合氯醛3 ml/kg經(jīng)腹腔注射麻醉，參照Pringle法〔6〕建立肝IR模型:正中剖腹，用無創(chuàng)血管夾將肝動脈、門靜脈及膽管一并夾閉，阻斷肝門30 min，開放再灌注180 min。SH組僅暴露但不結(jié)扎;P組于阻斷肝門前經(jīng)尾靜脈注射丙泊酚20 mg/kg，20 mg·kg-1·h-1靜脈維持至處死。

1.2.2 標本采集及肺濕干重比(W/D)計算 模型制備成功后處死實驗動物，取右上肺葉稱濕重，置于80℃烘箱中48 h烘烤至恒重，取出后稱干重，計算肺W/D。

1.2.3 免疫組化法檢測肺組織Nrf2，HO-1蛋白表達及病理學觀察 取右肺中葉置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，采用免疫組織化學檢測Nrf2，HO-1的表達。石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，滴加0.3%H2O2，室溫靜置10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，水洗2 min，進行高溫水浴行抗原修復，山羊血清室溫封閉30 min，滴加兔抗大鼠Nrf2和兔抗大鼠HO-1多克隆抗體(一抗，1∶100)于4℃過夜，37℃水浴復溫30 min，滴加生物素化山羊抗兔過氧化物酶標記二抗(1∶200)37℃孵育30 min，加入SABC復合物37℃孵育30 min，DAB顯色劑顯色5～10 min后蘇木素染核5～10 min，水洗，分化，藍化，透明，封片，陰性對照以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。光鏡下觀察并拍照，染成棕色的細胞為陽性細胞。在400倍視野下計數(shù)5個不重復視野，得出5個視野的平均數(shù)。100倍光學顯微鏡下觀察肺組織病理學結(jié)果。

1.2.4 Western印跡行肺組織Nrf2，HO-1蛋白檢測 肺組織秤質(zhì)量，用液氮研磨至粉末，加蛋白裂解液30 min，冰浴勻漿，4℃ 15 000 r/min離心15 min，取上清，Bradford法蛋白定量，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?0 μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，一抗(Nrf2 1∶100，HO-1 1∶100)4℃封閉過夜;Tris緩沖鹽沖洗膜5 min，3次，加入辣根過氧化物酶標記二抗IgG(1∶2 000)，室溫下孵育1 h，Tris緩沖鹽洗膜5 min，3次。以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參?；瘜W發(fā)光試劑顯影，暗室曝光沖片，膠片經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)掃描、成像，測定單位光密度，并將各組Nrf2、HO-1密度值分別與β-actin密度值的比值作為相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 Western印跡表達及肺W/D 與SH組比較，IR組和P組Nrf2和HO-1蛋白表達水平及肺W/D升高(P＜0.05);與IR組比較，P組Nrf2、HO-1表達水平升高(P＜0.05)，肺W/D降低(P＜0.05)。見表1，圖1。

表1 各組肺W/D、Nrf2、HO-1表達水平比較(n=8，±s)

表1 各組肺W/D、Nrf2、HO-1表達水平比較(n=8，±s)

組別 HO-1 NRF2 肺W/D SH組0.01±0.007 0.34±0.11 4.09±0.14 IR組 0.39±0.09 0.61±0.06 4.83±0.18 P組0.58±0.13 0.89±0.14 4.39±0.27

圖1 Western印跡檢測結(jié)果

2.2 免疫組化法檢測 各組Nrf2、HO-1表達水平 三組、Nrf2、HO-1表達水平有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。見圖2。

2.3 病理學變化 SH組肺組織結(jié)構(gòu)正常，IR組肺泡壁破壞嚴重，肺毛細血管明顯擴張、充血，肺間質(zhì)水腫，肺泡間隔增寬;P組肺泡間隔增寬，組織損傷較IR組明顯減輕。見圖3。

圖3 各組病理學比較(HE，×100)

3 討論

本實驗參照 Pringle法，通過肝缺血 30 min，再灌注180 min，建立大鼠肝IR后ALI模型，實驗結(jié)果表明，IR組大鼠肺W/D較SH組明顯升高，病理學顯示IR組肺組織結(jié)構(gòu)明顯出現(xiàn)破壞，提示肝IR后ALI模型制備成功。

肝IR損傷是由缺血的直接損傷及鈣離子超載、中性粒細胞活化引發(fā)“呼吸爆發(fā)”，產(chǎn)生大量自由基和促炎癥細胞因子〔白細胞介素-1和腫瘤壞死因子(TNF)-α等〕、內(nèi)皮細胞等多種因素介導的多臟器功能受損的復雜病理生理過程。其中釋放的自由基和促炎癥細胞因子隨血液循環(huán)到達全身各個組織器官造成組織損傷和血管通透性增加，引起全身炎癥反應(yīng)。肺組織作為受損的靶器官之一，表現(xiàn)為間質(zhì)增生、中性粒細胞浸潤、肺泡腔內(nèi)各種炎性因子的釋放，進而造成肺功能的嚴重受損。目前認為氧自由基及其引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是肝IR后ALI的主要機制。

HO-1又稱熱休克蛋白32(Hsp32)，是一種限速酶，存在于多個器官與組織中，正常情況下表達較少，而在熱休克、IR、缺氧等因素誘導下表達明顯增加。HO-1可催化血紅素生成一氧化碳(CO)、膽綠素和鐵離子，在抗氧化應(yīng)激、抗炎、抑制細胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用〔7〕;同時有研究表明，HO-1的保護作用還可能與減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)活性以對抗細胞凋亡和TNF-α水平有關(guān)。本實驗結(jié)果提示丙泊酚能誘導HO-1在IR損傷中的表達增加。丙泊酚誘導HO-1表達的增加可能與Nrf2-ARE激活HO-1有關(guān)〔8〕。

近年來的研究表明，Nrf2-ARE相互作用調(diào)節(jié)編碼抗氧化蛋白，是內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激的核心通路。生理狀態(tài)下，Nrf2在細胞質(zhì)中與它的抑制蛋白果蠅肌動蛋白結(jié)合蛋白(Kelch)結(jié)合，并通過Keap1蛋白將其錨定于由激動蛋白構(gòu)成的細胞骨架上，從而無法進入細胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性〔9〕。而Nrf2-ARE的激活是通過非激酶依賴性途徑和激酶依賴性途徑來實現(xiàn)的。非激酶依賴性途徑包括親核物質(zhì)、氧化應(yīng)激反應(yīng)中產(chǎn)生的活性氧(ROS)〔10〕等，激酶依賴性途徑包括磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)途徑〔11〕等。本實驗結(jié)果提示IR組Nrf2蛋白含量明顯高于SH組，可能與Nrf2的非激酶依賴性途徑被激活有關(guān)。丙泊酚可活化PI3K/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(PI3K/AKT)信號通路〔12〕，使PI3K表達上升，提示丙泊酚參與了Nrf2的激活，而該通路的激活與Nrf2的激酶依賴性途徑有關(guān)。Okouchi等〔13〕發(fā)現(xiàn)胰島素可以通過激活PI3K/AKT信號通路促進Nrf2的核轉(zhuǎn)移和誘導靶基因的表達，與本實驗結(jié)合相符。激活的Nrf2發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，與ARE相互作用，啟動下游編碼抗氧化蛋白如HO-1，使HO-1表達上升，與本實驗結(jié)果相符。

綜上所述，丙泊酚預先給藥可通過活化Nrf2-ARE信號通路，提高HO-1表達水平，從而減輕肝臟IR誘發(fā)大鼠的ALI。

1 Miranda LE，Capellini VK，Reis GS，et al.Effects of partial liver ischemia followed by global liver reperfusion on the remote tissue expression of nitric oxide synthase:lungs and kidneys〔J〕.Transplant Proc，2010;42(5):1557-62.

2 Yu X，Kensler T.Nrf2 as a target for cancer chemoprevention〔J〕.Mutat Res，2005;591(1-2):93-102.

3 Arslan M，Comu FM，Isik B，et al.Effects of the general anaesthetic agent，propofol，on erythrocyte deformability〔J〕.Bratisl Lek Listy，2010;111(3):126-8.

4 Nugroho AK，Romeljn SG，Zwier R，et al.Pharmacokinetics and pharmacodynamics analysis of transdermal iontophoresis of 5-OH-DPAT in rats:in vitro-in vivo correlation〔J〕.J Pharm Sci，2006;95(7):1570-85.

5 蓋毅文，來柄祺，成少利，等.丙泊酚對大鼠肝缺血再灌注后肺組織損傷保護作用〔J〕. 現(xiàn)代腫瘤學，2009;17(11)，2068-70.

6 Pannen BH，Al-Adili F，Bauer M，et al.Role of endothelins and nitric oxide in hepatic reperfusion injury in the rat〔J〕.Hepatology，1998;27(3):755-64.

7 李 航，段惠軍.Nrf2/ARE信號通路及其調(diào)控的抗氧化蛋白〔J〕.中國藥理學通報，2011;27(3):300-3.

8 邵建林，周銀燕，陳華梅，等.七氟烷通過P70S6K/Nrf2信號通路誘導神經(jīng)元HO-1mRNA表達〔J〕.中國藥理學通報，2009;25(2):209-12.

9 Kobayashi A，Kang MI，Watai Y，et al.Oxidative and electrophilic stresses activate Nrf2 through inhibition of ubiquitination activity of Keap1〔J〕.Mol Cell Biol，2006;26(1):221-9.

10 Dietz BM，Liu D，Hagos GK，et al.Angelica sinensis and its alkylphthalides induce the detoxification enzyme NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 by alkylating Keap1〔J〕.Chem Res Toxicol，2008;21(10):1939-48.

11 江 剛，戴愛國，胡瑞成.Nrf2調(diào)控γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表達與慢性阻塞性肺疾病〔J〕.國際呼吸雜志，2007;27(4):265-9.

12 趙琳琳，李俊芳，朱珊珊，等.丙泊酚預處理通過活化PI3K/Akt通路減輕脂多糖誘導的大鼠急性肺損傷〔J〕.徐州醫(yī)學院學報，2012;32(1):1-5.

13 Okouchi M，Okayama N，Alexander JS，et al.NRF2-dependent glutamate-L-cysteine ligase catalytic subunit expression mediates insulin protection against hyerglycemia-induced brain endothelial cell apoptosis〔J〕.Curr Neurovasc Res，2006;3(4):249-61.