石 峰 王建軍 王曉飛 (中國石油天然氣集團公司中心醫(yī)院，河北 廊坊 065000)

近年多發(fā)性骨髓瘤(MM)發(fā)病率逐年上升，治療緩解率低，死亡率高〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)IL-8可能影響MM生物學(xué)的許多方面包括漿細胞增殖和骨髓環(huán)境，且IL-8啟動子-251位的單核苷酸多態(tài)性與腫瘤的發(fā)生及耐藥性都有很大關(guān)系〔2〕，但是具體機制不明確。因此我們研究不同基因型MM細胞株對硼替佐米(萬珂)的敏感度。

1 資料與方法

1.1 細胞株 本實驗所用MM細胞株有Karpas 707，W63，U-1996，U-266，IM-9，8226/S，MM.1S，ARH-77，H929，8226/I，均購自中科院上海生化細胞研究所。

1.2 主要試劑 含10%的新生小牛血清，青霉素100 U/ml，鏈霉100 U/ml，RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國GIBCO公司產(chǎn)品?；蚪MDNA小量抽提試劑盒、Taq master mix，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，根據(jù)熒光定量PCR試劑盒均購自康維世紀公司。人白細胞介素8(IL-8)ELISA檢測試劑盒購自博凌科為公司。引物由上海生工合成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 細胞培養(yǎng)及基因組DNA提取 各種MM細胞株培養(yǎng)于含10%小牛血清及青、鏈霉素各100 U/ml的RPMI1640培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中。每2天換一次液。待細胞生長至95%左右的融合時，用含0.25%胰蛋白酶的消化液消化細胞，終止消化后將細胞輕輕吹打成單細胞懸液，按1∶3傳代培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的細胞株換液并PBS沖洗，室溫離心5 min，棄去離心管中上清液，獲得細胞沉淀，將之重懸于200 μl中。按基因組DNA小量抽提試劑盒說明書抽提細胞DNA。

1.4 細胞株SNP位點基因型檢測 為擴增IL-8基因啟動子區(qū)-251位前后共555 bp序列設(shè)計如下PCR引物:上游引物:正義鏈5'GAAGCACATGTGCCCCTTCACTCTG 3'，下游引物:反義鏈5'TCATCACCCTACTAGAGAACTTATG 3'，PCR反應(yīng)體系為20μl，反應(yīng)條件為:95 ℃ 5min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃30 s，40個循環(huán);72℃ 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR效果。用MfeI對擴增PCR產(chǎn)物消化，在5%瓊脂糖凝膠上分析。

1.5 MTT法測定萬珂對不同基因型細胞株效力 將鑒定出的三種不同基因型細胞株分別培養(yǎng)至對數(shù)期。胰蛋白酶消化后，用含10%的牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液配成2×104個/ml細胞懸液，接種于 96 孔板，每孔 200 μl，置 37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，實驗組加濃度為260 nmol/L的萬珂，并設(shè)不加入萬珂的空白對照組，每組重復(fù)10孔，無細胞孔為背景，放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，棄上清液，每孔加含0.2 mg/ml MTT的無血清培養(yǎng)基200 μl，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，棄上清液，加入200 μl DMSO，用酶標儀測波長570 nm處的OD值以判斷活細胞數(shù)，計算細胞抑制率。

1.6 各細胞株中IL-8 RNA表達的水平的檢測 取處于對數(shù)生長期的細胞在培養(yǎng)瓶中用冰PBS洗滌兩次后，加入1 ml Trizol，后按照試劑盒說明書對總RNA進行抽提。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒條件，采用 20 μl體系 55℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ min，反轉(zhuǎn)錄出cDNA存放于-20℃?zhèn)溆?。根?jù)熒光定量PCR試劑盒使用說明，采用 25 μl體系 55℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s循環(huán)40次。72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，采用熒光定量PCR檢測系統(tǒng)分析。實驗中采用β-actin作為對照。引物如下:IL-8:5'-CACTTTTGCCAAGGAGTGCTAA-3'，3'-CCCGTGCAATATCTAGGAAAATC-5'， 513 bp。 β-actin:5'-CCCAAGGCCAACCGCGAGAAGAT-3'，3'-GTCCCGGCCAGCCAGGTCCAG-5'，219 bp。

1.7 細胞株培養(yǎng)上清中IL-8濃度的檢測 各細胞株分別培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取細胞培養(yǎng)上清液，離心10 min去除顆粒和聚合物，按照人IL-8 ELISA檢測試劑盒說明書，對各基因型細胞株培養(yǎng)上清液中IL-8的含量進行檢測。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進行相關(guān)資料處理。數(shù)據(jù)以±s表示，兩組之間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 MM各細胞株IL-8啟動子區(qū)-251位基因多態(tài)性鑒定 經(jīng)過PCR擴增后酶切鑒定，純合子T/T將產(chǎn)生108 bp產(chǎn)物，雜合子A/T將產(chǎn)生108，76和32 bp產(chǎn)物，純合子A/A將產(chǎn)生76和32 bp產(chǎn)物(圖1)。經(jīng)過鑒定，純合子T/T的細胞系有W63、8226/I、ARH-77，雜合子 A/T 的細胞系有 IM-9、Karpas 707、H929、MM.1S、ARH-77、8226/S，純合子 A/A 的細胞系有:U-1996、U-266。

圖1 基因型鑒定結(jié)果

2.2 萬珂對不同基因型細胞株效力 選取W63、Karpas 707、U-1996細胞株分別為基因型純合子T/T、雜合子A/T、純合子A/A的代表來進行測試。此結(jié)果證明MM細胞株中基因型為純合子 A/A細胞株對萬珂最敏感〔細胞抑制率(82.9±3.8)%〕，相反T/T細胞株最不敏感〔抑制率(68.4±3.0%)〕。而A/T位于其中間〔抑制率(74.6±1.9)%〕。

2.3 各基因型細胞株培養(yǎng)液上清中IL-8的含量與細胞中該基因mRNA的關(guān)系 TT、AT和AA三種基因型IL-8 mRNA的CT值分別為18.63±3.25，20.63±3.73，21.94±3.74，蛋白表達量分別為 110.73±14.42，118.96±21.64，120.54±19.43(pg/ml)。不同基因型的細胞株表達的IL-8蛋白表達量不同，純合子A/A細胞株表達量最高，雜合子次之，純合子T/T反應(yīng)最低，而且蛋白量的變化與該基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA變化一致。

3 討論

MM治療已經(jīng)有了快速的發(fā)展，出現(xiàn)許多新藥，比如萬珂，沙利度胺。很多研究都集中在細胞因子的作用上，其控制腫瘤生長，進展和轉(zhuǎn)移。這種作用包括如下的白細胞介素:IL-1β，IL-2 和它的可溶性受體，IL-8，IL-10，IL-11 和 TNF-β〔3〕。在促炎細胞因子和趨化因子中，IL-8是急性和慢性初始和擴大炎癥反應(yīng)過程中主要因子〔4〕，是CXC化學(xué)因子家族一員，潛在的中性粒細胞和淋巴細胞的誘導(dǎo)劑〔5，6〕。IL-8調(diào)節(jié)化學(xué)誘導(dǎo)通過兩種不同的受體:IL8RA和 IL8RB。IL-8對這兩個受體有高親和性，通過G-蛋白激活的第二信使系統(tǒng)傳遞信號〔7〕。研究證實IL-8還可以誘導(dǎo)細胞擴增，移位和血管生成。

萬珂是合成的硼酸二肽，對MM和MM細胞株有多種作用，包括阻止核因子-kappa B 活性(NF-κB)〔8〕。同時，已知幾乎所有的MM細胞株表明都表達CD28，而在正常B細胞或者漿細胞中不表達。CD28通過NF-kB信號通路在MM中上調(diào)內(nèi)源性基因表達的功能，包括IL-8(56)。并且，MM患者骨髓基質(zhì)細胞中IL-8產(chǎn)生加多已經(jīng)被證實。另外，IL-8產(chǎn)物與疾病活動，臨床過程有關(guān)，并依賴于IL-1β和NF-κB信號(31)。本文發(fā)現(xiàn)MM細胞株中IL-8啟動子區(qū)-251 A等位基因可以增加基因表達而提高IL-8水平，A/T和A/A基因型可能更有效結(jié)合NF-kB而導(dǎo)致過度表達。而萬珂又能抑制NF-κB的活性，這也解釋了A/A基因型對萬珂最為敏感這一現(xiàn)象。通過本研究，初步認為IL-8可以成為治療檢測MM的一個重要指標。

1 Greipp PR，Sanmiguel J，Durie BG，et al.International staging system for multiple myeloma〔J〕.J Clin Oncol，2005;23(15):3412-20.

2 Schadendorf D，Moller A，Algermissen B，et al.IL-8 produced by human malignant melanoma cells in vitro is an essential autocrine growth factor〔J〕.J Immunol，1993;151(5):2667-75.

3 Lauta VM.A review of the cytokine network in multiple myeloma〔J〕.Cancer，2003;97(10):2440-52.

4 Harada A，Sekido N，Akahoshi T，et al.Essential involvement of interleukin-8(IL-8)in acute inflammation〔J〕.J Leukocyte Biol，1994;56(5):559-64.

5 Matsushima K，Baldwin E，Mukaida N.Interleukin-8 and MCAF:novel leukocyte recruitment and activating cytokines(Part 1 of 2)〔J〕.Chem Immunol，1992;51(1):236-65.

6 Roebuck KA.Regulation of interleukin-8 gene expression〔J〕.J Interferon Cytokine Res，1999;19(5):429-38.

7 王曉桃，莫東華，陳蓓莉，等.趨化因子受體介導(dǎo)巨噬細胞炎癥蛋白-1α對多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖與遷移的影響〔J〕.腫瘤，2008;28(3):232-5.

8 Bruno B，Rotta M，Giaccone L，et al.New drugs for treatment of multiple myeloma〔J〕.Lancet Oncol，2004;5(7):430-42.