趙 妍 楊 超 王若蘭 宋永令

ZHAO YanYANG ChaoWANG Ruo－lanSONG Yong－ling

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

（College of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou，Henan 450001，China）

大多數(shù)果蔬產(chǎn)品的生產(chǎn)受到季節(jié)性和地域性的限制，往往集中在某一地區(qū)、某個時令大量上市，而目前中國果蔬類產(chǎn)品的采后保鮮系統(tǒng)還不完善，因此常常出現(xiàn)大量果蔬采摘后因處理不當(dāng)而遭受病原微生物侵染以致腐爛變質(zhì)的現(xiàn)象［1］。鈣鹽可以作為一種品質(zhì)保護(hù)劑應(yīng)用于果蔬采后保鮮，研究［2］表明其能夠減緩果實(shí)貯藏過程中品質(zhì)下降速率，這對于提高果實(shí)耐貯性有著積極的作用。

中國是蘋果生產(chǎn)的第一大國，據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計，2010年中國蘋果產(chǎn)量為3 326萬t，接近世界總產(chǎn)量的一半［3］。河南省地處黃河故道，是中國蘋果的主要產(chǎn)區(qū)之一，因此，采后貯藏保鮮也是該地區(qū)蘋果產(chǎn)業(yè)中的一項(xiàng)重要研究課 題［3］。蘋果炭疽病是由炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）侵染所致，該病在中國北方蘋果產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生。之前的大量研究表明：采后CaCl2浸泡處理可抑制蘋果的呼吸作用，延緩蘋果衰老［4］；而采前噴施CaCl2可以增加蘋果果實(shí)鈣含量、降低苦痘病等生理病害的發(fā)病率、并顯著增加果實(shí)大小，改善著色品質(zhì)［5］。但沒有關(guān)于采后應(yīng)用非化學(xué)殺菌劑CaCl2防治河南省蘋果產(chǎn)區(qū)的炭疽病害、提高該地區(qū)果實(shí)抗病性的報道。吳芳芳等［6］研究認(rèn)為CaCl2對C.gloeosporioides有一定的抑制作用，但并未對經(jīng)CaCl2處理之后的蘋果果實(shí)品質(zhì)及抗病性做具體研究。本試驗(yàn)重點(diǎn)探討CaCl2處理對河南產(chǎn)區(qū)蘋果采后炭疽病害、貯藏品質(zhì)及果實(shí)抗病性的影響，以期為該地區(qū)蘋果采后非化學(xué)殺菌劑保藏提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和病原菌

試驗(yàn)用蘋果品種為“首紅”，七、八成熟時采摘于河南省滎陽蘋果園。試驗(yàn)用蘋果選取大小適中、顏色均勻、未被病蟲害侵染、表皮無機(jī)械傷的果實(shí)。

病原菌蘋果炭疽菌（C.gloeosporioides）分離于自然發(fā)病的蘋果果實(shí)，由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）鑒定。該菌種使用前于PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)7d，試驗(yàn)用孢子懸浮液用含有0.05%吐溫－20的無菌水配置，其濃度為5×104個／mL。

1.2 CaCl2 抑菌試驗(yàn)

1.2.1C.gloeosporioides菌落直徑測定 根據(jù)文獻(xiàn)［7］測定不同濃度的CaCl2溶液（1%，2%，5%，10%）對病原菌C.gloeosporioides菌落直徑的影響。不同CaCl2濃度均做3次平行試驗(yàn)。

1.2.2 孢子萌發(fā)率測定 根據(jù)文獻(xiàn)［7］測定不同濃度的CaCl2溶液（1%，2%，5%，10%）對病原菌C.gloeosporioides孢子萌發(fā)率的影響。不同CaCl2濃度各做3次平行試驗(yàn)。

1.2.3 果實(shí)接種試驗(yàn)－病斑直徑測定 首先配置1%次氯酸鈉溶液，將供試果實(shí)浸泡其中消毒1min，之后果實(shí)分別浸入濃度為1%，2%，5%，10%的CaCl2溶液中（無菌水做對照，浸泡時間為10min）。

果實(shí)晾干后于赤道部位打一3mm×3mm的傷口并將配置好的C.gloeosporioides孢子懸浮液（15μL）接種于傷口中。果實(shí)貯藏于冷藏條件下（4℃，28d）并于貯藏期結(jié)束后測量果實(shí)病斑直徑（采用十字交叉法）。每種濃度CaCl2溶液處理的果實(shí)數(shù)為30個，并做3次重復(fù)。

1.3 果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)測定

蘋果果實(shí)經(jīng)預(yù)處理之后置于恒溫恒濕箱中貯藏（4℃，28d），每7d取樣測定果實(shí)的可滴定酸值、VC含量、可溶性固形物含量及果實(shí)硬度。試驗(yàn)所用果實(shí)數(shù)目為10個×3重復(fù)＝30個。

1.3.1 可滴定酸值 采用GB 12293－90中的電位滴定法。

1.3.2 VC含量 依據(jù)文獻(xiàn)［8］，采用2，4－二硝基苯肼比色法。

1.3.3 可溶性固形物含量 采用手持折光儀測定。

1.3.4 蘋果硬度測定方法 在蘋果赤道部位兩兩相對取四點(diǎn)，使用FT327型果實(shí)硬度計配套的削皮器去果皮，插入硬度計測量，結(jié)果取4點(diǎn)平均值，單位轉(zhuǎn)化為牛頓（N）。

1.4 果實(shí)病理指標(biāo)測定

蘋果果實(shí)預(yù)處理之后置于恒溫恒濕箱中貯藏（4℃，28d），每7d取樣測定果實(shí)木質(zhì)素、總酚、MDA（丙二醛）含量及PAL（苯丙氨酸解氨酶）活性。每處理隨機(jī)選取10個果實(shí)，整個試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.1 木質(zhì)素含量測定 木質(zhì)素在植物抗病過程中發(fā)揮重要作用，其可限制病菌酶和病原菌分泌的毒素向寄主植物的擴(kuò)散，同時限制了病原菌從寄主植物吸取水分和營養(yǎng)物質(zhì)。木質(zhì)素測定方法參照文獻(xiàn)［9］并作部分修正。稱取蘋果果肉2g，加入95%乙醇研磨并離心抽濾。所余果肉殘渣放入鋁盒中干燥（105℃，1h）。干燥產(chǎn)物放入10mL具塞試管中，加入3mL乙酰溴－乙酸混合液（體積比1∶3），70℃下水浴30min。結(jié)束后置于冰水中、加入0.9mL濃度為2mol／L的NaOH終止反應(yīng)，用冰乙酸定容至10mL。離心后取上清液0.5mL于10mL具塞試管中定容。280nm處測定吸光度，木質(zhì)素含量用吸光度表示。

1.4.2 總酚含量測定 酚類化合物與植物的抗病性有密切關(guān)系，能夠抑制真菌孢子萌發(fā)和菌絲生長，還能夠鈍化真菌分泌的一些酶?？偡訕?biāo)準(zhǔn)曲線以沒食子酸配制。測定方法：稱取果肉樣品1g，用70%丙酮研磨，定容至40mL后超聲15min，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去丙酮，剩余勻漿離心后取上清液用乙醇定容至50mL，再吸取1mL用甲醇定容至50mL。取上清液1mL，置于25mL具塞試管內(nèi)，其余操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線制備部分，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算試管中總酚含量，并按式（1）計算果實(shí)總酚含量。

式中：

R—— 總酚含量（以沒食子酸計），mg／g；

m——25mL試管中總酚含量，mg／g；

M—— 所取果肉質(zhì)量，g。

1.4.3 MDA含量測定 植物衰老會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝平衡被破壞，產(chǎn)生大量自由基，自由基毒害會引發(fā)膜脂過氧化作用，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，而 MDA是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物之一。其測定方法：稱取2g蘋果果肉，加入5mL TCA溶液（100g／L），研磨勻漿后冷凍離心20min（4℃，12 000r／min），取上清液2mL置于試管中，而空白組為2mL TCA溶液。分別向試驗(yàn)及空白組加入2mL濃度為0.67%的TBA，混勻煮沸20min后冷卻。取上清液分別測定其在450，532，600nm的吸光值、計算果肉樣品 MDA含量，結(jié)果以μmol／g·FW 表示。

1.4.4 PAL活性測定 PAL是植物苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶，其活性的高低與植物抗性反應(yīng)中木質(zhì)素、酚類物質(zhì)、植物抗毒素等的生物合成有直接關(guān)系。參照文獻(xiàn)［10］的方法加以改進(jìn)：稱取2g蘋果果肉，加入4mL硼酸硼砂緩沖液（100mM，pH 8.7）冰浴研磨成均漿，4℃下12 000r／min冷凍離心20min，取上清液用于酶活測定。以每小時290nm吸光值增加0.01為一個酶活單位（U）。酶活性以U／g·FW（鮮重）表示。

1.5 統(tǒng)計分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 8.2統(tǒng)計軟件進(jìn)行鄧肯氏多重差異比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 CaCl2對C.gloeosporioides的抑制效果

由表1可知，CaCl2對C.gloeosporioides的菌絲生長、孢子萌發(fā)以及由其侵染所造成的蘋果采后炭疽病均有明顯抑制作用。體外試驗(yàn)結(jié)果顯示：當(dāng)CaCl2濃度為1%時就可以顯著地抑制C.gloeosporioides的菌絲生長與孢子萌發(fā)（P＜0.05），且CaCl2濃度增大，對于C.gloeosporioides的抑制能力增強(qiáng)。果實(shí)接種試驗(yàn)結(jié)果顯示：CaCl2濃度為2%時就可以顯著地抑制蘋果炭疽病病班直徑的擴(kuò)展，當(dāng)CaCl2濃度上升到10%時，該效果更加顯著（P＜0.05）。

2.2 蘋果果實(shí)貯期主要品質(zhì)指標(biāo)變化規(guī)律

由圖1（a）可知，隨著儲藏期的延長，各處理組蘋果果實(shí)可滴定酸值均呈下降趨勢。CaCl2處理可以減緩蘋果果實(shí)可滴定酸值的下降速率，貯藏7d之后，10%和5%濃度CaCl2處理組果實(shí)可滴定酸值分別為0.66，0.50mmol／100g，是對照的1.63和1.25倍。

表1 CaCl2對C.gloeosporioides的抑制效果?Table1 The inhibitory effect of CaCl2 to C.gloeosporioides

由圖1（b）可知，貯藏期間各組果實(shí)VC含量變化趨勢相似，均隨時間延長而逐漸下降。CaCl2處理不同程度地延緩了蘋果果實(shí)VC的下降趨勢，在貯藏期間，10%和5%濃度CaCl2處理組果實(shí)VC含量均顯著地高于對照（P＜0.05）。

貯藏期間由于果實(shí)的呼吸作用和能量消耗，可溶性固形物含量均呈緩慢下降的趨勢，CaCl2處理同樣可以延緩蘋果果實(shí)可溶性固形物的下降趨勢，且該效果與CaCl2使用濃度呈正相關(guān)（圖1（c））。

蘋果果實(shí)采摘后內(nèi)部乙烯含量上升，后熟作用漸強(qiáng)，呼吸作用增大，分解和消耗更多的有機(jī)物和糖類，果實(shí)漸漸衰老，硬度減小。由圖1（d）可知，CaCl2處理對于維持蘋果果實(shí)硬度效果顯著，整個貯藏期間除了前7d，1%CaCl2處理組果實(shí)硬度與對照組無顯著差異之外，其余各組果實(shí)硬度均顯著地高于對照（P＜0.05），同樣的，該效果與CaCl2使用濃度呈正相關(guān)。

圖1 CaCl2對蘋果貯期可滴定酸、VC、可溶性固形物含量和硬度的影響Figure1 Influence of CaCl2on the titratable acidity，vitamin C，soluble solids contents and firmness of apple fruit

2.3 蘋果果實(shí)貯期抗病性相關(guān)指標(biāo)變化規(guī)律

由圖2（a）可知，各組木質(zhì)素含量均呈上升趨勢，在第14天時達(dá)到峰值，之后緩慢下降。整個貯藏期間，對照組木質(zhì)素含量始終處于最低水平。在第14～28天時，各濃度CaCl2處理組果實(shí)其木質(zhì)素含量均顯著地高于對照，其中尤以10%濃度CaCl2處理的效果最為顯著（P＜0.05）。

由圖2（b）可知，各組果實(shí)總酚含量均在貯期的第14天達(dá)到峰值，之后迅速下降。在第14～28天時，經(jīng)10%濃度CaCl2處理的果實(shí)其總酚含量始終維持在最高水平，顯著地高于對照和其它3個CaCl2處理組（P＜0.05）。

CaCl2處理顯著地提高了蘋果果實(shí)貯期PAL活性，由圖2（c）可知，在第14～28天時，各個CaCl2處理組果實(shí)其PAL活性均顯著地高于對照（P＜0.05），且該效果與CaCl2的使用濃度呈正相關(guān)。

由圖2（d）可知，各處理組果實(shí)MDA含量在第7天均達(dá)到峰值，推測是由于冷藏環(huán)境造成果實(shí)應(yīng)激條件下積累大量活性氧，進(jìn)而攻擊自身細(xì)胞膜，產(chǎn)生膜脂過氧化產(chǎn)物所致。其中，對照組 MDA含量最高，為1.84μmol／g·FW，顯著高于10%及5%濃度CaCl2處理組（P＜0.05）。隨后的第7～21天，各組果實(shí)MDA含量迅速下降，而貯藏末期（第21～28天）均有不同程度的回升，尤以對照組變化明顯，其MDA含量顯著地高于其它各組（P＜0.05），這可能是由于貯藏末期果實(shí)衰老，品質(zhì)下降所致。

圖2 CaCl2對蘋果貯期木質(zhì)素、總酚、MDA含量及PAL活性的影響Figure2 Influence of CaCl2on the content of lignin，total phenolic，MDA and PAL activity of apple fruit

3 結(jié)論

（1）CaCl2對C.gloeosporioides有一定的抑制作用，體外試驗(yàn)中可以顯著抑制其菌絲生長與孢子萌發(fā)，體內(nèi)試驗(yàn)則可以顯著降低其對蘋果果實(shí)的侵染能力，且該效果與其使用濃度呈明顯正相關(guān)關(guān)系。蘋果果實(shí)在貯藏期內(nèi)主要品質(zhì)指標(biāo)均隨時間推移而下降，但CaCl2處理能夠明顯減緩果實(shí)品質(zhì)下降趨勢，該效果同樣與CaCl2使用濃度正相關(guān)。10%濃度CaCl2處理可以誘導(dǎo)蘋果果實(shí)PAL活性升高并顯著減少M(fèi)DA積累以保護(hù)細(xì)胞膜通透性，同時果實(shí)木質(zhì)素與總酚含量均顯著高于對照，與之相應(yīng)的是蘋果果實(shí)對于炭疽病的防御能力增強(qiáng)。

（2）隨著貯藏期的延長，果實(shí)逐漸衰老，主要品質(zhì)指標(biāo)如可滴定酸、VC、可溶性固形物含量下降，但CaCl2處理能夠延緩其下降速率，這和前人的研究結(jié)論［11］相一致，主要是由于外源鈣能抑制呼吸基質(zhì)的代謝，降低線粒體活力，從而降低果實(shí)的呼吸作用，延緩果實(shí)的衰老。此外，CaCl2處理能夠增加蘋果果實(shí)硬度，該試驗(yàn)結(jié)果與對于其它果蔬的研究結(jié)論［12，13］相一致。之前的研究結(jié)果證實(shí)：PAL是植物苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶，其活性升高會促進(jìn)木質(zhì)素、酚類物質(zhì)等的生物合成［14］，而果實(shí)傷口處細(xì)胞壁沉積的木質(zhì)素及酚類物質(zhì)會在傷口處形成屏障，阻止水分散失、病原菌入侵或?qū)Σ≡兄苯佣拘裕?5］。本研究表明CaCl2處理可以誘導(dǎo)蘋果果實(shí)PAL活性上升、木質(zhì)素及總酚含量升高，并增強(qiáng)對C.gloeosporioides侵染的抵御能力，該結(jié)果符合前人的研究結(jié)論并進(jìn)一步豐富了相關(guān)理論知識。

（3）本試驗(yàn)主要研究了CaCl2處理對河南地區(qū)蘋果采后炭疽病的防治效果，而對其它可能發(fā)生的采后病害如輪紋病、黑星病等未做研究，今后將加大研究范圍；此外，本研究采用的蘋果果實(shí)儲藏條件為4℃，并未對常溫貯藏條件下的相應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行測定，今后將補(bǔ)充完善本部分內(nèi)容；最后，本試驗(yàn)研究表明CaCl2處理可以誘導(dǎo)蘋果果實(shí)采后抗病性，但并未對誘導(dǎo)機(jī)理從分子水平進(jìn)行闡明，今后擬將采用基因組學(xué)的分析方法細(xì)致深入的探討蘋果采后抗病性的誘導(dǎo)機(jī)理。

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