王 冰，程麗靜，劉明川，高政南

(1.大連市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧大連 116033;2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿內(nèi)科，遼寧大連 116027;3.大連醫(yī)科大學(xué)研究生院，遼寧大連 116044)

糖尿病小鼠肝臟脂肪酸合成酶的動(dòng)態(tài)表達(dá)

王 冰1，程麗靜2，劉明川3，高政南1

(1.大連市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧大連 116033;2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿內(nèi)科，遼寧大連 116027;3.大連醫(yī)科大學(xué)研究生院，遼寧大連 116044)

目的 觀察1型、2型糖尿病小鼠肝臟脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)表達(dá)的改變，探討其在糖尿病肝臟脂質(zhì)代謝紊亂中的意義。方法 1型糖尿病小鼠模型以鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)，對(duì)照組小鼠應(yīng)用等量生理鹽水。2型糖尿病小鼠模型選取C57BL/6基因背景下瘦素受體基因缺陷小鼠，純合子db/db小鼠入選實(shí)驗(yàn)組;雜合子db/m小鼠入選對(duì)照組。應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)FAS在肝臟定位;應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)、Western印跡方法，分別從mRNA水平、蛋白水平檢測(cè)FAS在1型、2型糖尿病小鼠肝臟表達(dá)的變化。結(jié)果 FAS蛋白在肝臟廣泛表達(dá)，主要位于肝細(xì)胞的胞漿內(nèi)。1型糖尿病小鼠HbA1c水平(5.45±0.56)%明顯高于對(duì)照組(2.93±0.08)%(P＜0.05)，血甘油三酯(triglyceride，TG)水平(2.25 ±0.66)mmol/L 高于對(duì)照組(0.99 ±0.46)mmol/L(P＜0.05)，血膽固醇(cholesterin，CHO)水平(1.90 ±0.12)mmol/L 高于對(duì)照組(1.62 ±0.10)mmol/L(P＜0.05);FAS的mRNA水平約為對(duì)照組的1.4倍，F(xiàn)AS在蛋白水平也明顯高于對(duì)照組。2型糖尿病小鼠HbA1c水平(5.73±0.33)%明顯高于對(duì)照組(3.90 ±0.07)%(P＜0.05)，db/db鼠也存在明顯高脂血癥，血 TG 水平(2.85 ±0.24)mmol/L高于對(duì)照組(0.87 ±0.40)mmol/L(P＜0.05)，血 CHO 水平(3.60 ±0.98)mmol/L 高于對(duì)照組(1.73±0.50)mmol/L(P＜0.05);FAS mRNA水平約為對(duì)照組的2.7倍，蛋白印跡顯示db/db鼠肝臟FAS也明顯高于db/m鼠。結(jié)論 1型、2型糖尿病小鼠均存在不同程度的脂質(zhì)代謝紊亂，其肝臟FAS的含量，無(wú)論從mRNA水平還是蛋白水平均較正常小鼠明顯增高。

糖尿病;脂代謝紊亂;脂肪酸合成酶

脂肪肝是糖尿病常見(jiàn)的并發(fā)癥，有多種因素能夠促進(jìn)糖尿病患者脂肪肝的發(fā)生和發(fā)展，其中肝臟脂質(zhì)代謝異常是其發(fā)生的重要原因之一。FAS是內(nèi)源性脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，含有脂肪酸合成所需的全部酶活性，在糖尿病患者脂肪肝的發(fā)病過(guò)程中可能具有重要作用。本研究旨在探討FAS在糖尿病小鼠肝臟表達(dá)的改變及其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1型糖尿病小鼠模型:選取7周齡、18～20 g、雄性、C57BL/6小鼠，應(yīng)用STZ 50 mg/kg腹腔注射，1次/d，連續(xù)5 d，再觀察5 d，若小鼠出現(xiàn)明顯糖尿病癥狀:多飲、多尿、多食、體重減輕，空腹血糖＞16.4 mmol/L入選實(shí)驗(yàn)組;同類(lèi)小鼠應(yīng)用等量生理鹽水(NS)腹腔注射相同時(shí)間入選對(duì)照組，每組5只小鼠。

2型糖尿病小鼠模型:16周齡、雄性、C57BL/6背景下瘦素受體基因缺陷小鼠，實(shí)驗(yàn)組為純合子db/db小鼠;對(duì)照組為雜合子db/m小鼠。每組5只小鼠。

小鼠在處死之前禁食6 h，處死前稱(chēng)重，將小鼠麻醉后，取心臟血，送檢糖化血紅蛋白(HbA1c)和血脂水平。

1.2 主要藥品試劑

STZ購(gòu)自北京天來(lái)生物醫(yī)學(xué)科技有限公司;免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京中山生物制劑公司;PCR引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成;兔來(lái)源FAS多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

免疫組織化學(xué)染色:正常小鼠肝臟組織石蠟切片依次經(jīng)過(guò)脫蠟、水化、封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、滴加兔來(lái)源FAS多克隆抗體(濃度為1∶100)37℃孵育1 h、滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(濃度為1∶500)、DAB顯色等步驟。分別以封閉液作陰性對(duì)照，以脂肪組織染色作陽(yáng)性對(duì)照。

Real-time PCR:定量檢測(cè)FAS的mRNA水平。參照RNA trip說(shuō)明書(shū)提取肝組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA模板后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。β-actin為內(nèi)參，SYBR Green作檢測(cè)染料，設(shè)對(duì)照組相對(duì)表達(dá)量為100%，計(jì)算目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量的變化。

引物序列:

小鼠 FAS(132 bp)上游:5’-AGGGGTCGACCTGGTCCTCA -3’，下游:5’-GCCATGCCCAGA -GGGTGGTT -3’;

β-actin(293 bp)上游:5’-ATCTGGCACCACACCTTC-3’，下游:5’-AGCCAGGTCCAGACG -CA -3’。

小鼠FAS的PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min，94 ℃，30 s;63 ℃，30 s;72 ℃，30 s，共 35 個(gè)循環(huán)，最后72℃，7 min總延伸。

Western印跡法:采用常規(guī)方法提取小鼠肝臟總蛋白并定量，取100 μg進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉1 h，加兔來(lái)源FAS多克隆抗體(1∶500)室溫孵育1 h，洗膜后加羊抗兔IgG(1∶5000)室溫孵育1 h，洗膜后進(jìn)行化學(xué)法發(fā)光。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用軟件SPSS 13.0，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較均數(shù)間的差異，單因素隨機(jī)組方差分析進(jìn)行組間的均數(shù)比較，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FAS蛋白在正常小鼠肝臟的分布

免疫組化結(jié)果顯示，C57BL/6小鼠肝臟細(xì)胞胞漿顯色為黃色，中央靜脈周?chē)皡R管區(qū)呈棕黃色，F(xiàn)AS蛋白在肝臟廣泛表達(dá)，主要位于肝細(xì)胞的胞漿內(nèi)，在中央靜脈周?chē)皡R管區(qū)等血運(yùn)豐富的區(qū)域表達(dá)更為明顯，見(jiàn)圖1。

2.2 1型糖尿病小鼠HbA1c、TG和CHO水平

1型糖尿病小鼠HbA1c、TG和CHO水平，均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

圖1 正常小鼠肝臟上FAS蛋白的表達(dá)Fig 1 FAS protein expression in the mouse liver

表1 1型糖尿病小鼠與對(duì)照組HbA1c、TG和CHO水平Tab 1 Comparison of HbA1c、TG and CHO between type 1 diabetes mouse and control group

2.3 1型糖尿病小鼠肝臟FAS的mRNA水平

1型糖尿病小鼠肝臟FAS的mRNA水平較對(duì)照組明顯增加，約為對(duì)照組的1.4倍(P＜0.05)。

2.4 1型糖尿病小鼠肝臟FAS的蛋白水平

在蛋白水平，1型糖尿病小鼠肝臟FAS的蛋白含量明顯高于對(duì)照組小鼠(圖2)。

2.5 2型糖尿病小鼠HbA1c、TG和CHO水平

2型糖尿病小鼠HbA1c、血TG和血CHO水平均高于對(duì)照組(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

圖2 1型糖尿病小鼠肝臟FAS蛋白含量Fig 2 The protein level of FAS in liver of type 1 diabetes mouse

表2 2型糖尿病小鼠與對(duì)照組HbA1c、TG和CHO水平Tab 2 Comparison of HbA1c、TG and CHO between type 2 diabetes mouse and control group

2.6 2型糖尿病小鼠肝臟FAS的mRNA水平

2型糖尿病db/db鼠肝臟FAS mRNA水平較對(duì)照組 db/m鼠明顯上調(diào)，約為對(duì)照組的 2.7倍(P ＜0.05)。

2.7 2型糖尿病小鼠肝臟FAS的蛋白水平

在蛋白水平，db/db鼠肝臟FAS的蛋白含量也明顯高于對(duì)照db/m鼠(圖3)。

圖3 2型糖尿病小鼠肝臟FAS蛋白含量Fig 3 The protein level of FAS in liver of type 2 diabetes mouse

3 討 論

隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，糖尿病已成為中國(guó)繼心腦血管疾病和腫瘤之后的第三大疾病。脂質(zhì)代謝異常是糖尿病，特別是2型糖尿病的重要慢性并發(fā)癥。眾所周知，肝臟在脂類(lèi)的消化、吸收、合成、分解及運(yùn)輸中發(fā)揮著重要作用，甘油三酯在肝臟合成過(guò)多和/或分解障礙，均能使血漿甘油三酯升高，高甘油三酯血癥作為危險(xiǎn)因子，與脂肪肝的發(fā)生關(guān)系密切。

FAS是催化乙酰輔酶A、丙二酸單酰輔酶A和NADPH合成飽和長(zhǎng)鏈脂肪酸的關(guān)鍵酶［1-4］。它能催化1個(gè)分子的乙酰輔酶A和7個(gè)分子的丙二酸單酰輔酶A，經(jīng)轉(zhuǎn)酰、縮合、還原、脫水和再還原的7次重復(fù)過(guò)程合成脂肪酸，而脂肪酸是合成甘油三酯的重要原料。糖尿病的脂質(zhì)代謝紊亂很可能與肝臟FAS表達(dá)的變化有關(guān)。

此次研究結(jié)果顯示，F(xiàn)AS蛋白在C57BL/6小鼠肝臟上廣泛表達(dá)，主要表達(dá)于肝細(xì)胞胞漿內(nèi)，在中央靜脈周?chē)蛥R管區(qū)肝細(xì)胞表達(dá)量較其他部位稍高，這可能與這些部位血運(yùn)豐富和代謝旺盛有關(guān)。FAS蛋白在肝臟有廣泛表達(dá)，為進(jìn)一步研究提供了先決條件。本實(shí)驗(yàn)分別選擇用1型和2型糖尿病小鼠模型觀察FAS在糖尿病小鼠肝臟上表達(dá)的改變。多次、小劑量STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型具有高血糖、體重減輕、多飲多食多尿的特點(diǎn)，與臨床1型糖尿病吻合，為經(jīng)典的1型糖尿病小鼠模型構(gòu)建方法。C57BL/6背景下瘦素受體基因缺陷的db/db小鼠是一種遺傳性肥胖型2型糖尿病模型，具有高血糖、高胰島素血癥、高甘油三酯血癥和胰島素抵抗等特征，是研究2型糖尿病的理想模型。研究表明:1型糖尿病小鼠和2型糖尿病小鼠均存在不同程度的血脂異常，即高膽固醇血癥及高甘油三酯血癥，此與糖尿病患者的臨床特點(diǎn)相吻合，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所選用的兩種小鼠模型極具代表性。本次研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組小鼠相比，1型糖尿病小鼠肝臟上的FAS含量，無(wú)論mRNA水平，還是蛋白水平，與對(duì)照組比較均明顯增高。在2型糖尿病模型中也有類(lèi)似發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照的db/m小鼠相比，db/db小鼠肝臟呈脂肪肝表現(xiàn)，其FAS在mRNA水平和蛋白水平表達(dá)量均明顯增高。由此推測(cè)，糖尿病狀態(tài)下，小鼠肝臟FAS的高表達(dá)可能與糖尿病高糖狀態(tài)下肝臟脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān)。高血糖狀態(tài)下，肝臟的FAS表達(dá)量上調(diào)，因而導(dǎo)致肝臟甘油三酯的合成增多，從而導(dǎo)致脂肪肝形成。究其FAS高表達(dá)的原因，可能與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)改變有關(guān)。

固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)是脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子［5-6］，可激活脂肪酸合成所需的所有基因，其蛋白水平的增加，可直接激活多個(gè)參與脂肪酸合成的酶，包括 FAS［7-8］、硬脂酰輔酶 A去飽和酶(SCD-1)［9］和乙酰輔酶 A羧化酶(ACC)［10］等。碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(carbohydrate responsive element binding protein，ChREBP)是新發(fā)現(xiàn)的脂質(zhì)調(diào)控的重要基因［11-12］。分析FAS的啟動(dòng)子區(qū)可發(fā)現(xiàn)固醇調(diào)節(jié)元件(SRE)、碳水化合物反應(yīng)元件(ChRE)，由此可見(jiàn)，F(xiàn)AS是SREBP-1c和ChREBP兩種重要脂質(zhì)調(diào)控基因的靶基因，可在轉(zhuǎn)錄水平受到他們的調(diào)節(jié)。已有研究證實(shí)，db/db小鼠肝臟上的 SREBP-1c和 ChREBP，無(wú)論是在mRNA水平，還是在蛋白水平，均有明顯增加。因此有理由推測(cè)，糖尿病狀態(tài)下肝臟FAS表達(dá)的增加，可能是受到SREBP-1c和ChREBP的雙重調(diào)控作用。

總之，本研究通過(guò)對(duì)糖尿病小鼠肝臟FAS表達(dá)的研究，探討了糖尿病脂質(zhì)代謝紊亂的可能機(jī)制。FAS表達(dá)異?？赡苁翘悄虿「闻K脂質(zhì)生成的重要原因，從而為進(jìn)一步研究糖尿病時(shí)脂質(zhì)代謝紊亂的原因提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Dynamic expression of fatty acid synthase in the liver of diabetic mouse

WANG Bing1，CHENG Li-jing2，LIU Ming-chuan3，GAO Zheng-nan1
(1.Department of Endocrine，Dalian Municipal Central Hospital，Dalian116033，China;2.Department of Nephrology，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116027，China;3.Graduate School，Dalian Medical University，Dalian116044，China)

［Abstract］ObjectiveTo investigate the expression of fatty acid synthase in the liver of type 1 and type 2 diabetic mouse.MethodsType 1 diabetes mouse model induced by Streptozotocin and mouse in control group were given the same volume of NS.Leptin receptor-deficient(db/db)mouse on C57BL/6 background were used as type 2 diabetic mouse model and db/m were used as control.Immunostaining was used to detect the FAS protein expression in the liver.Real- time PCR and Western blot were used to detect the expression of FAS in the liver of diabetic mouse on mRNA and protein level.ResultsFAS was abundantly expressed in liver，especially in cytoplasm of liver cells.Compared with the control group，type 1 diabetic mouse showed higher level of HbA1c，TG and CHO.The HbA1c levels were higher than that in control group(5.45 ±0.56)%vs(2.93 ±0.08)%;The serum TG levels were higher than that in control group(2.25 ±0.66)mmol/L vs(0.99 ± 0.46)mmol/L.The serum CHO levels were higher than that in control group(1.90 ± 0.12)mmol/L vs(1.62 ±0.10)mmol/L.The mRNA level of FAS in the liver of type 1 diabetic mouse was dramatic higher than control group，increased about 1.4 times.At the protein level，F(xiàn)AS in liver of type 1 diabetic mouse was increased compared with the control.Similarly with type 1 diabetic mouse，type 2 diabetic mouse showed higher level of HbA1c and dramatic hyperlipemia.The HbA1c levels were higher than that in control group(5.73 ±0.33)%vs(3.90 ±0.07)%;The serum TG levels were higher than that in control group(2.85 ±0.24)mmol/L vs(0.87 ±0.40)mmol/L.The serum CHO levels were higher than that in control group(3.60 ±0.98)mmol/L vs(1.73 ±0.50)mmol/L.FAS in liver of db/db mouse was induced about 2.7 times as much as that of db/m mouse at the mRNA level.At the protein level，F(xiàn)AS in liver of db/db mouse was increased compared with the control.ConclusionThere existed dyslipidemia in diabetic mouse including Type 1 and Type 2，Liver expression of FAS was increase in Type 1 and Type 2 diabetic mouse were increased control with control.

［Key words］diabetes;dyslipidemia;fatty acid synthase

R589.2

A

1671-7295(2013)02-0130-05

王冰，程麗靜，劉明川，等.糖尿病小鼠肝臟脂肪酸合成酶的動(dòng)態(tài)表達(dá)［J］.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35(2):130-134.

10.11724/jdmu.2013.02.08

王 冰(1981-)，女，遼寧錦州人，主治醫(yī)師，碩士。E-mail:wangbing_1999_1981@163.com

高政南，主任醫(yī)師。E-mail:gao2008@163.com

2012-11-22;

2013-02-28)