劉麗禹順英邵陽張燃謝斌

大量研究表明，遺傳因素在品行障礙（Conduct Disorder，CD）的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[1-2]，而且遺傳導致的神經(jīng)發(fā)育異?？赡芘cCD的核心癥狀如沖動、暴力攻擊等密切相關。2011年Dick等[3]對CD者癥狀的全基因組關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子相關蛋白7（C1QTNF7）基因中的rs16891867、rs7950811、rs11838918、rs1861046 和rs4698107與 CD 癥狀相關（P<5×10-8）。目前C1QTNF7的作用機制并不明確，可能與血漿中腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）水平有關[3]。既往研究顯示TNF水平與生活事件應激反應、HPA軸調(diào)節(jié)及防御方式有關[4-6]，而應激不僅與CD的形成有關，而且應激所致的HPA軸功能改變也與青少年暴力等行為問題存在密切聯(lián)系。但目前國內(nèi)外尚缺乏此基因與CD的關聯(lián)研究，故本研究對中國漢族男性青少年CD患者中C1QTNF7基因多態(tài)性是否與CD的發(fā)生相關進行探討。此外，大量研究表明，CD與注意缺陷多動障礙（Attention Deficit Hyperactivity Disorder，ADHD）共病率較高，可能存在共同的遺傳基礎[7]，因此本研究又根據(jù)患者是否共病ADHD分組，進一步探討其共病機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 來自因犯罪而新入上海未成年人管理教養(yǎng)所（以下簡稱少管所）的男性青少年，案件性質(zhì)包括搶劫、傷害、擾亂治安、盜竊和詐騙等。符合《美國精神障礙分類與診斷統(tǒng)計手冊第四版》（The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，DSM-IV）CD的診斷標準；排除嚴重的心臟疾病、肝、腎功能損害及血液疾病者、嚴重消化系統(tǒng)疾病者、嚴重營養(yǎng)不良者，以及合并有明顯神經(jīng)、精神疾病史者。符合標準的對象在取得本人以及法定監(jiān)護人的知情同意之后正式入組。由兩名主治以上醫(yī)師對CD患者明確診斷，并由專職研究員使用國際神經(jīng)精神科簡式訪談問卷（mini-mental state examination，MINI）5.0.0中文版復核診斷。共72例CD患者符合以上標準并最終入組，年齡16～18歲，平均（17.07±0.85）歲。根據(jù)DSM-IV中ADHD的診斷標準將CD組又再分為ADHD組（22例）和非ADHD組（50例），平均年齡分別為17.12歲和17.05歲，兩組年齡比較無統(tǒng)計學差異（t=0.484,P=0.63）。

對照組來自本市某區(qū)健康體檢站體檢人群。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)CD的高峰年齡一般認為是15～18歲[8]，18歲之后性格特質(zhì)穩(wěn)定，CD行為發(fā)生率顯著減少或消失。故對照組納入標準設為年齡18歲以上，并且18歲之前無CD無ADHD行為的漢族男性健康體檢者。體檢時由專職研究員使用MINI問卷5.0.0中文版進行篩查。排除標準同病例組。共收集178名對照，年齡18～60歲，平均（24.24±7.34）歲，與CD組的年齡存在統(tǒng)計學差異（t=12.77，P<0.05）。

所有研究對象對本研究知情同意并簽署知情同意書。本研究獲得上海交通大學醫(yī)學院附屬精神衛(wèi)生中心倫理委員會審核批準。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 因在少管所內(nèi)采集靜脈血存在一定困難，故CD組采用口腔黏膜拭子采集黏膜細胞，用特異性結(jié)合DNA的離心吸附柱試劑盒（美國ABI公司訂制）提取DNA，凍存于－80℃冰箱待測。對照組采集靜脈血5mL，EDTA抗凝，用酚氯仿法在當天或次日提取DNA，凍存于－80℃冰箱待測。

1.2.2 基因多態(tài)性檢測 本研究根據(jù)全基因組關聯(lián)研究（Genome Wide Association Studies，GWAS）陽性結(jié)果，以及HapMap數(shù)據(jù)庫中中國北京漢族（Chinese Han origin in Beijing，CHB）數(shù)據(jù)，根據(jù)最小等位基因頻率（Minor Allele Frequency，MAF）＞10%，連鎖不平衡系數(shù)（R2）＞0.8，進行篩選，最終選擇rs4698107和rs16891867兩個位點進行檢測。

使用SnaPshot法進行基因分型，rs4698107PCR引物 F-CAGGGCTCCCACTGATTCTA，R-CGCAGATGCACTTGTGTCTT，合成片段589bp，延伸引物為ATTGTCTTCCATGAAACCAGTCCCTGGTGCCAAAACGTTC。rs16891867 PCR引物F-CCACAACCCAGTTAAAAGAGG，R-TTAAAACAGTGTCTTTGGAGTCAA，合成片段381bp，延伸引物為AATGACACCGAAAAAACAGCAGAAAATTGTAAGACCTACTCTGTGCTGAGAAAAT。PCR擴增反應體系為15μL，DNA（原液）2μL，dNTP Mixture（2.5mM）0.5μL，10 × PCR Buffer（Takara）1.5μL，Taq HS（Takara）（5U/μL）0.15μL，引 物（0.2μL+0.2μL）（10pmol/μL），以滅菌水補足到15μL。PCR反應程序：95℃ 2min（95℃ 40s＋60℃30s＋72℃ 1min 30s）×35cycle 72℃ 8min。將 PCR產(chǎn)物取5μL進行2.5%瓊脂糖電泳檢測。PCR產(chǎn)物純化：10μL SAP 酶（Takara）（1U/μL）1μl，ExonI酶（Takara）（5U/μL）1μL，反應溫度為 37℃ 80min和85℃15min。延伸反應反應體系15μL；反應溫度96℃ 1min（96℃ 10s＋50℃ 5s＋60℃ 30s）×28cycle。純化：PCR 產(chǎn)物 10μL，SAP酶（Takara）（1U/μL）1μL，反應溫度：37℃ 80min，75℃ 15min。ABI 3130XL測序儀測序，原始數(shù)據(jù)分析采用Gene-Mapper 4.1。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 13.0和SHEsis在線軟件（http://analysis2.bio-x.cn/myAnalysis.php）進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。采用χ2檢驗分析單位點基因型分布是否符合Hardy-weinberg平衡法則，χ2檢驗用于比較各位點基因型、等位基因頻率在病例組和對照組間的分布差異。運用SHEsis在線軟件構(gòu)建單倍體進行單體型分析，單體型是指位于一條染色體特定區(qū)域的一組相互關聯(lián)并傾向于以整體遺傳給后代的單核苷酸多態(tài)的組合，單體型分析是根據(jù)實際數(shù)據(jù)推斷預測的結(jié)果，結(jié)果使用期望值表示。檢驗水準α為0.05，雙側(cè)檢驗。將CD組被試根據(jù)是否存在ADHD分亞組，用χ2檢驗比較三組各位點的基因型和等位基因頻率，兩兩比較采用Bonferroni法調(diào)整檢驗水準，調(diào)整后α為0.017。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗 經(jīng)χ2檢驗單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）rs4698107和rs16891867在CD組（χ2分別為0.44和0.92）以及對照組（χ2分別為0.06和0.08）均符合Hardy-weinberg平衡定律（均P>0.05），CD組和對照組具有群體代表性。

2.2 CD組與對照組C1QTNF7基因兩位點多態(tài)性分析 CD組中rs4698107位點A等位基因頻率高于對照組（χ2=5.027，P=0.025），OR 值為 1.72，95%CI為（1.07，2.76），基因型分布在兩組中存在統(tǒng)計學差異（χ2=8.051，P=0.018）。rs16891867的等位基因頻率（χ2=0.625，P>0.05）和基因型（χ2=1.123，P>0.05）分布在兩組中無統(tǒng)計學差異。見表1。兩組兩位點單體型分布無統(tǒng)計學差異（χ2=3.690，P>0.05）。見表2。

表1 CD組與對照組C1QTNF7兩位點基因頻率、基因型的比較（n，%）1)

表2 CD組與對照組單體型rs4698107-rs16891867的比較1)

2.3 ADHD組、非ADHD組及對照組兩位點多態(tài)性分析 將CD組被試根據(jù)是否存在ADHD分亞組，比較三組各位點的基因型和等位基因頻率。三組中rs4698107等位基因分布無統(tǒng)計學差異（χ2=5.637，P>0.05）；基因型分布存在統(tǒng)計學差異（χ2=12.842，P=0.012），進一步兩兩比較，ADHD組與對照組間基因型分布存在統(tǒng)計學差異（χ2=11.544，P=0.003）。rs16891867位點等位基因頻率和基因型在三組中的分布均無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。見表3。

表3 兩個SNP基因頻率與基因型的比較（n，%）1)

3 討論

品行障礙（CD）是臨床上常見的一類破壞性行為障礙，有關的病因?qū)W研究提示CD具有遺傳基礎，遺傳度達40%～50%[1]。目前對CD候選基因的研究主要包括單胺氧化酶A（monoamine oxidase A，MAOA）、5-羥色胺轉(zhuǎn)運體（serotonin transporter,5-HTT）、兒茶酚胺甲氧基轉(zhuǎn)移酶（catechol-O-methyltransferase，COMT）和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）等[9]，但研究結(jié)果并不一致，因此有必要對CD可能的遺傳位點繼續(xù)探討。

C1QTNF7基因位于4號染色體短臂15.3區(qū)。GWAS研究發(fā)現(xiàn)，C1QTNF7中5個SNP與CD癥狀相關（P<5×10-8），此基因多個SNP與CD有顯著相關性，而且多位點間完全連鎖不平衡程度不高[3]。因此有理由相信C1QTNF7基因多態(tài)性與CD癥狀存在相關性，但國內(nèi)外未有研究報道證實。C1QTNF7影響CD的機制仍然不明確，可能與血漿中TNF水平有關。眾多研究表明，TNF水平的增高與敵意、憤怒和攻擊情緒密切相關[10-11]，而攻擊行為是CD的主要癥狀之一，因此腫瘤壞死因子相關基因可能會影響CD疾病的發(fā)生。本研究對男性青少年CD患者的C1QTNF7基因中rs16891867、rs4698107兩位點SNPs進行研究發(fā)現(xiàn)，CD組中rs4698107位點A等位基因頻率高于對照組，基因型分布在兩組間也存在統(tǒng)計學意義。rs16891867的等位基因頻率和基因型在兩組比較中無差異，與之前GWAS研究不一致?？赡艿脑蚴?，Dick等[3]的GWAS研究選取的人群是物質(zhì)依賴的患者，雖然物質(zhì)依賴與CD共病率較高，但其癥狀表現(xiàn)畢竟只有交叉而無必然的重疊，因此不一定存在完全相同的患病基因。同時，CD發(fā)生的具體機制不明確，環(huán)境、心理社會因素也起到重要作用，而且本研究對象都是青少年男性CD患者，而且樣本量較小，因此可能會有一定的偏倚結(jié)果產(chǎn)生。

當對CD組按是否共患多動障礙（ADHD）分組時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rs4698107位點基因型在三組比較中存在統(tǒng)計學差異，進一步分析發(fā)現(xiàn)伴有ADHD的CD患者基因型與對照組比較存在統(tǒng)計學意義，而不伴有ADHD的CD患者與對照組之間沒有發(fā)現(xiàn)差異。臨床資料顯示10歲以前的兒童中，ADHD和CD共患病率高達54%[12]，兩種疾病間可能存在共同的遺傳機制，含有rs4698107 A等位基因的青少年可能更容易共病，而在不伴有ADHD的CD患者中沒有發(fā)現(xiàn)差異，可能與分亞型后各組樣本量減少，導致檢驗效能下降而出現(xiàn)假陰性有關。

本研究也存在一定的局限性。首先，因樣本收集有一定的難度，樣本量較小，結(jié)果的可靠性還需大樣本研究的驗證。而且本研究對象來自因犯罪而新入少管所的男性青少年，樣本有一定局限性，未考慮疾病嚴重程度、犯罪性質(zhì)及人格特質(zhì)等[13]，所以本研究結(jié)果可為將來的研究提供一個新的研究方向。其次，對于ADHD的診斷訪談是基于研究對象本人，未訪談患兒家長，因此ADHD有可能漏診。綜上所述，本研究僅為初步結(jié)果，具有一定的參考價值，今后有待于更多臨床試驗的進一步研究。

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