杜景霞，張永健

(1.邢臺醫(yī)學高等?？茖W校，河北 邢臺 054000;2.河北醫(yī)科大學，河北 石家莊 050017)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的早期階段，是指由心源性以外各種肺內外致病因素引起的急性、進行性缺氧性呼吸衰竭，是肺部炎癥和通透性增加的綜合征，嚴重威脅著人類的健康。肺血管內皮細胞的改變在急性肺損傷中十分重要[1]，肺毛細血管內皮細胞在細菌內毒素(lippopolysaccharide，LPS)、細胞因子、氧自由基等的作用下，其通透性增高，分泌和釋放各種炎癥介質和細胞因子，如腫瘤壞死因子 α(TNF－α)、白細胞介素1β(IL－1β)、白細胞介素 2(IL－2)、白細胞介素6(IL－6)，以及黏附分子(ICAM －1，ECAM －1，VCAM －1，E －selection)、趨 化 因 子(C3，MCP－1)，使肺血管內皮細胞受損，從而導致ALI。敗血癥時，細菌內毒素是導致ALI的重要因素之一。LPS是革蘭陰性細菌細胞壁的主要成分，向動物血管內注入LPS能引起嚴重肺內炎癥和組織損傷，是ALI體內研究的經典模型之一。本研究中整體觀察了LPS對大鼠肺血管通透性的影響，肺泡上皮細胞Ca2+濃度，肺泡灌洗液中蛋白的變化，TNF－α含量變化等，以探討鈣拮抗劑間－尼索地平對脂多糖誘導的ALI是否有保護作用，為ALI治療提供新的思路?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

低溫離心機(英泰TGL16M);超低溫冰箱(美國MDF－290AT型);丹吉爾數字醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)(山東丹吉爾電子有限公司);電熱真空干燥箱(上海?，攲嶒炘O備有限公司);Floustar多功能微板分析儀(德國BMG公司)。大腸桿菌脂多糖(美國Sigma公司);丙二醛(MDA)試劑盒，蛋白測定試劑盒，TNF－αELISA試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司。

1.2 動物及分組

取60只雄性清潔級SD大鼠，體重250～350 g，隨機分成3組，每組各20只。分組包括生理鹽水組(A組)、模型組(B組)、間－尼索地平組(C組)。

1.3 動物模型制備及給藥方法

A組和B組均用羧甲基纖維素鈉灌胃，C組予間－尼索地平2.0mg/kg灌胃，灌胃體積均為每 100 g體重 1.5mL，30min后，B組和C組經尾靜脈給予5mg/kg的脂多糖進行造模，A組經尾靜脈給予等體積的生理鹽水。

1.4 取材及標本制備

制備血清:造模后6 h，分別將對應組別大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉30mg/kg進行麻醉，打開腹腔，從下腔靜脈取血，靜置30min以上，4℃ 3 000 r/min離心15min，－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

支氣管－肺泡灌洗液(BALF):開胸腔結扎右肺，暴露氣管，行氣管插管，用6mL無菌4℃生理鹽水分3次行左支氣管肺泡灌洗液，回收率超過80%。將BALF以1 000 r/min離心10min，取出上清，上清再以3 000 r/min離心10min，分裝，－80℃ 凍存。

病理切片:取右肺中、上葉用于W/D測定，右肺下葉用10%中性福爾馬林固定，行病理切片檢查。

肺組織勻漿液制備:每組另外選10只大鼠，取出左肺，用濾紙吸干血液和水分后稱重，剪碎組織，以1∶9比例加入生理鹽水，用細胞破碎儀在冰浴條件下破碎組織10 s，共3次。將制成的混懸液以4℃、3 000 r/min離心15min，吸取上清分裝，－80℃保存，待用。

肺泡上皮細胞內Ca2+濃度檢測:取出各組右肺，檢測Ca2+濃度。

1.5 檢測指標與方法

病理學觀察:肉眼觀察肺組織的病理改變，常規(guī)包埋、切片，HE染色，光鏡觀察肺組織。BALF中TNF－α和蛋白含量測定:?。?0℃ 凍存BALF上清液，室溫水浴快速化凍，按試劑盒操作說明書分別測定TNF－α和蛋白含量。肺W/D值計算:取右肺上葉，用濾紙沾干水分及血液，稱重，然后置真空干燥箱中80℃烘烤24 h，稱干重，計算肺W/D值。肺組織中MDA含量、血清蛋白質含量測定:?。?0℃ 凍存肺組織勻漿液上清，室溫水浴快速化凍，按試劑盒操作說明書分別進行MDA的測定，在全自動生化分析儀測得血清蛋白質含量。肺毛細血管通透指數(CPI)測定:CPI=BALF中蛋白含量/血清蛋白質含量。肺泡上皮細胞內Ca2+濃度檢測:將取出的右肺組織細胞沉淀用D－Hanks液制成密度為105～106的細胞懸液(臺盼藍排斥試驗，活細胞大于90%)，用流式細胞儀進行熒光檢測，測出標本熒光強度 F。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0 forWindows軟件包。所有數據均以±s表示，采用 t檢驗。顯著性水準α=0.05。

2 結果

2.1 肺組織病理變化

B組小鼠肺泡間隔增寬，氣道管腔內有大量的中性粒細胞聚集，可見肺組織水腫，點、片狀出血;C組肺損傷明顯減輕，仍有輕度肺組織水腫、出血。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化

2.2 BALF中 TNF－α和 MDA含量

結果見表1。造模后(B組和C組)BALF中TNF－α含量顯著升高(P＜0.01)。與 A 組比較，B組BALF中TNF－α，MDA及蛋白質含量均顯著升高(P＜0.01或P＜0.05)，而C組比 B組則顯著下降(P ＜0.05)。

2.3 肺W/D值及CPI

結果見表1。與A組比較，B組大鼠肺W/D值及CPI明顯增加(P ＜0.01)，而 C 組比 B 組顯著下降(P ＜0.01或 P ＜0.05)。

2.4 肺泡上皮細胞內Ca2+濃度

見圖2。

3 討論

目前認為，脂多糖誘導ALI主要通過多種信號轉導途徑、基因表達、酶活性及功能蛋白含量調節(jié)等方面起作用。脂多糖可以通過與效應細胞膜上的受體系統(tǒng)(包括多個蛋白分子，如CD14，TLR4，CXCR4，HSP70，HSPgO 等)相互作用，結合于單核 － 巨噬細胞、中性粒細胞及內皮細胞[2]，從而啟動細胞內信號轉導系統(tǒng)基因轉錄，產生多種趨化因子，引起大量中性粒細胞在肺微血管內聚集，然后與內皮細胞黏附，釋放脂質過氧化物、血小板活化因子、花生四烯酸、蛋白酶等介質，造成內皮細胞、肺泡上皮細胞和間質成分受損，以致肺泡毛細血管通透性增加，導致肺水腫[3]。本研究中通過觀察脂多糖致傷后6 h肺W/D值、BALF中TNF－α及MDA值、肺毛細血管通透指數、肺泡上皮細胞內Ca2+濃度等指標，成功地復制了急性肺損傷模型。

表1 各組大鼠觀察指標比較(± s，n=10)

表1 各組大鼠觀察指標比較(± s，n=10)

注:與 A 組比較，□P ＜0.05，■P ＜0.01;與 B 組比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01。

組別A組B組C組TNF－α(ng/L)262.6 ±63.7 560.40±121.1■430.5 ±102.3■▲MDA(nmol/mg)5.61±0.59 8.69±1.04■6.24±0.86▲蛋白質含量(g/L)0.44 ±0.13 0.96 ±0.24■0.73 ±0.23△CPI 13.27 ±3.2 32.30 ±6.5■19.86 ±7.0□▲W/D 4.23±0.17 4.98±0.30■4.61±0.39△

圖2 各組肺泡上皮細胞內Ca2+濃度比較

Ca2+是維持人體生命活動的重要元素，在維持肌肉的收縮性、促進糖原和蛋白的轉換以及維持血管平滑肌的張力方面起著很重要的作用，同時，細胞內游離鈣離子(Ca2+)在細胞信號轉導中起重要的第二信使和信號轉導作用。金勝威[4]的研究結果表明，LPS可刺激小鼠RAW264.7巨噬細胞的鈣內流，細胞內游離鈣離子濃度的升高是產生活性氧的必要條件[5]，升高的細胞內Ca2+可激活活性氧合成酶和線粒體呼吸鏈的氧自由基形成[6]。ALI時肺泡上皮細胞內Ca2+濃度明顯升高，引起肺泡－毛細血管膜通透性增加，肺血管內與間質間隙之間液體交換障礙，導致液體聚集于肺泡和間質間隙，發(fā)生肺水腫[7]。

目前認為，ALI發(fā)病過程中也有細胞凋亡的作用。關于細胞凋亡的發(fā)生發(fā)展，已有研究證明細胞內鈣超載是細胞凋亡發(fā)生過程中普遍存在的中間介質[8]。

鈣拮抗劑可通過阻止鈣離子過度內流而防止損傷時細胞Ca2+濃度明顯升高，減輕細胞損傷，同時通過阻止脂多糖信號向胞內轉導而影響致炎因子及其mRNA的表達，且通過清除氧自由基和抗氧化作用[9]而減輕體內脂質過氧化程度。在脂多糖作用下，L型慢通道鈣拮抗劑可通過阻斷鈣離子內流，減輕細胞內鈣離子過載，同時通過活化MAPK和PYK2信號通路引起核轉移因子(NF－κB，AP－1)移位，減少細胞凋亡，影響致炎因子及其mRNA的表達而起到肺保護作用[10]。

本研究中，間－尼索地平(2.0 mg/kg)對肺泡上皮細胞內Ca2+濃度影響與肺損傷減輕程度呈正相關，同時可見BALF中MDA及TNF－α含量、肺CPI及W/D值顯著降低，組織病理學檢查亦發(fā)現肺組織損傷程度有所減輕，說明該藥對脂多糖誘導的急性肺損傷有一定的保護作用。

[1]Luce JM.Acute lung injury and the acute respiratory distresssyndrome[J].CritCareMed，2003，29:369.

[2]Triantafilou M，Brandenburg K，KusUInoto S，etal.Combinational clustering of receptors following stimulation by bacterial products determines lipopolysaceharide responses[J].Bioehem J，2004，381(Pt2):527 － 536.

[3]Bierie B，Nozawa M，Renou JP，etal.Activation ofβ －catenin in prostate epithelium induces hyperplasias and squamous transdiffer－entiation[J].Oncogene，2003，22:3 875 － 3 887.

[4]金勝威.促炎癥消退介質脂氧素對內毒素性肺損傷的保護作用及機制[D].武漢:華中科技大學，2007.

[5]Lambeth JD.NOX enzymesand the biology of reactive oxygen[J].NatRev Immunol，2004，4:181 － 189.

[6]Hensley K，Robinson KA，Gabbita SP，etal.Reactive oxygen species，cell signaling，and cell injury[J].Free Radic Biol Med，2000，28:1 456 －1 462.

[7]范偉堂，孫曉峰.急性肺損傷新生大鼠肺泡上皮細胞內鈣離子變化的研究[J].吉林醫(yī)學，2012，33(16):3 365 －3 366.

[8]Chen SJ，Bradley ME，Lee TC.Chemical hypoxia triggers apoptosis of cultured neonatal rat cardiac myocytes:modulation by calcium－regulated proteases and protein kineses[J].Mol Cell Biochem，1998，178(2):141.

[9]Mason RP，Mak IT，Walter MF，etal.Antioxidantand cytoprotective activities of the calcium channel blocker mibefradil[J].Biochem Pharmacol，1998，55(11):1 843 －1 852.

[10]李 剛，祁曉平，許 哲，等.鈣通道阻滯劑對炎癥因子平衡的影響及肝保護作用[J].腸外與腸內營養(yǎng)，2005，12(6):325－328.