尚培中，李曉武，蔡大偉，溫艷春，谷化平，高占明

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，起病隱匿，癥狀和體征缺乏特異性，早期診斷困難，確診時(shí)大多已屬中晚期，手術(shù)切除率較低，5年生存率不足5%，其高病死率與高侵襲、轉(zhuǎn)移性密切相關(guān)［1-3］。研究證實(shí)，Midkine在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用［4-6］。本研究應(yīng)用免疫組化 EliVisionTMplus法對胰腺癌組織進(jìn)行Midkine檢測，旨在探討其表達(dá)與胰腺癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，為指導(dǎo)臨床治療提供理論依據(jù)，為判斷預(yù)后提供客觀標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集解放軍251醫(yī)院2000年3月1日—2010年2月28日胰腺癌根治性手術(shù)切除標(biāo)本70例，男44例，女26例;年齡33～79歲，平均62.3歲。均經(jīng)組織病理學(xué)診斷為原發(fā)性胰腺導(dǎo)管腺癌，其中高、中、低分化腺癌分別為25例、26例和19例;同時(shí)選取距腫瘤至少3 cm以上癌旁非腫瘤胰腺柔軟組織標(biāo)本15例。所有病例均無其他嚴(yán)重內(nèi)科疾病或其他惡性腫瘤，術(shù)前未行化療、放療及免疫治療。依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(International Union for Cancer Control，UICC)第6 版標(biāo)準(zhǔn)［7］進(jìn)行 TNM 分期。

1.2 方法 手術(shù)標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)制備4 μm厚切片，65℃烘烤備用。采用微波 －枸櫞酸鈉緩沖液修復(fù)抗原。兔抗人Midkine多克隆抗體、EliVisionTMplus免疫組化染色試劑盒、DAB顯色液均購自邁新生物技術(shù)有限公司。免疫組化染色采用EliVisionTMplus法，染色步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。用隨試劑所附已知陽性對照片做陽性對照，癌旁胰腺組織標(biāo)本做陰性對照，PBS溶液代替一抗做空白對照。

1.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 在未知患者臨床資料的情況下，由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師獨(dú)立對染色切片進(jìn)行觀察并確認(rèn)。在400倍光學(xué)顯微鏡下對每張切片任選5個(gè)視野進(jìn)行觀察。背景染色清晰，陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)比率＞5%為陽性，≤5%為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均通過SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。Midkine表達(dá)與胰腺癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，Kaplan-Meier法描繪生存曲線。α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 Midkine在不同胰腺組織中的表達(dá) 在胰腺癌細(xì)胞中Midkine陽性反應(yīng)主要定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，見圖1A。15例癌旁胰腺組織中均未見Midkine表達(dá)，見圖1B。Midkine在70例胰腺癌組織中陽性表達(dá)50例，陽性率為71.4%，陽性率顯著高于癌旁胰腺組織(χ2=26.02，P ＜0.05)。

圖1 Midkine在胰腺癌組織、癌旁胰腺組織中的表達(dá)(EliVisionTMplus法×200)

2.2 Midkine表達(dá)與胰腺癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系在性別、發(fā)病年齡及腫瘤生長部位方面，Midkine表達(dá)陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);但在腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，Midkine表達(dá)陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

2.3 Midkine表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 隨訪3年，1年累計(jì)總體生存率(overall survival，OS)為 40.0%(28/70)。其中，Midkine陽性患者1年累計(jì)生存率為19.6%，中位生存時(shí)間10個(gè)月，Midkine陰性患者1年累計(jì)生存率為79.2%，中位生存時(shí)間18個(gè)月。Midkine陰性患者預(yù)后明顯好于陽性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.19，P ＜0.05)，見圖2。

3 討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的本質(zhì)特征，也是影響患者預(yù)后的一個(gè)重要因素。細(xì)胞過度增殖和凋亡受抑制是侵襲和轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制，其能力強(qiáng)弱與癌基因的表達(dá)有關(guān)［8］。Midkine是1988年Kadomatsu等用差異雜交方法在視黃酸誘導(dǎo)的小鼠胚胎瘤細(xì)胞cDNA文庫中篩選出的一種基因，它與多向因子(pleiotrophin，PTN)共同組成一個(gè)新的肝素結(jié)合生長因子(HBGFs)家族。由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)、特殊的組織分布與抗凋亡、促血管新生等生物學(xué)功能，引起了腫瘤研究工作者的濃厚興趣，使其成為目前研究的熱點(diǎn)之一。Midkine在多種腫瘤組織內(nèi)，如腦腫瘤、口腔鱗狀細(xì)胞癌、唾液腺腫瘤、甲狀腺癌、乳腺癌、肺癌、食管癌、胃癌、胃腸道間質(zhì)瘤、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、子宮頸癌中表達(dá)水平異常升高，與腫瘤發(fā)展的進(jìn)程及嚴(yán)重程度密切相關(guān)，被認(rèn)為是一種多腫瘤的通用抗原［4-6，9-16］。

表1 Midkine表達(dá)與胰腺癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

圖2 Midkine表達(dá)陽性組與陰性組胰腺癌患者生存曲線

有關(guān)Midkine在胰腺癌組織中的表達(dá)有許多學(xué)者進(jìn)行了研究。Yoshida等［17］采用Northern印跡技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中Midkine呈陽性表達(dá)，而正常成人組織中幾乎無表達(dá)。徐軍等［18］采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRTPCR)技術(shù)，對Midkine mRNA分別進(jìn)行定性和定量測定，發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中Midkine mRNA表達(dá)明顯高于癌旁組織。馬松林等［19］應(yīng)用免疫組化SP法對比研究了Midkine及核增殖標(biāo)志物Ki-67在胰腺癌及正常胰腺組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Midkine表達(dá)與腫瘤組織學(xué)分級、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，認(rèn)為Midkine可能發(fā)揮了促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和抑制凋亡的作用。筆者應(yīng)用免疫組化EliVisionTMplus法對比觀察了胰腺癌和癌旁胰腺組織中Midkine的表達(dá)狀況，發(fā)現(xiàn)其在胰腺癌組織中陽性率為71.4%，而在癌旁胰腺組織中均呈陰性表達(dá)，證實(shí)其在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中具有一定作用。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，Midkine陽性表達(dá)與性別、年齡及胰腺癌生長部位無顯著相關(guān)性，但與腫瘤大小、分化程度、臨床TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示Midkine表達(dá)與胰腺上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。Midkine在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)越強(qiáng)，其惡性程度也隨之增高，癌細(xì)胞更容易侵襲周圍組織或發(fā)生轉(zhuǎn)移，表明它是促進(jìn)胰腺癌發(fā)生和發(fā)展的基因，其高表達(dá)是預(yù)后不良的標(biāo)志。本組Midkine陰性表達(dá)的20例術(shù)后總體累積生存率明顯高于陽性表達(dá)的50例，說明監(jiān)測Midkine表達(dá)狀況有助于更準(zhǔn)確地估測預(yù)后。

在各種惡性腫瘤細(xì)胞中，Midkine基因呈高強(qiáng)度、高頻率表達(dá)，且與患者預(yù)后密切相關(guān)，提示Midkine有可能成為腫瘤基因治療的新靶點(diǎn)。通過基因藥物阻斷Midkine表達(dá)，抑制其作用途徑，可以達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的目的。由于Midkine基因在腫瘤組織中優(yōu)先表達(dá)，Midkine啟動因子能被用于選擇性地表達(dá)腫瘤中的有害基因，如將胰腺癌Midkine基因5＇調(diào)控區(qū)域長約609對堿基的基因片斷經(jīng)單純皰疹病毒胸苷激酶轉(zhuǎn)導(dǎo)后，顯著提高了癌細(xì)胞對藥物前體及更昔洛韋的敏感性，從而影響腫瘤生長，故可將該段基因作為一種自殺基因片段［17，20］。Takei等［21］根據(jù)Midkine的二維結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了硫化磷酸酯修飾的反義寡脫氧核糖核苷酸(antisense oligodexynucleotides，asODN)，在體外和動物實(shí)驗(yàn)中用于鼠結(jié)腸癌細(xì)胞及神經(jīng)纖維瘤細(xì)胞等腫瘤基因治療，發(fā)現(xiàn)可明顯抑制細(xì)胞增生及瓊脂集落形成;將細(xì)胞種植于裸鼠，所形成的腫瘤明顯小于對照組。Midkine asODN主要是通過適度抑制腫瘤細(xì)胞的有絲分裂及腫瘤的血管生成來抑制腫瘤的生長，此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)提示Midkine asODN將來可能成為基因治療的靶向藥物之一。Inoh等［22］將阿霉素結(jié)合的抗 Midkine單克隆抗體與阿霉素共軛控制免疫球蛋白G進(jìn)行對比研究，發(fā)現(xiàn)前者對人肝癌細(xì)胞(HepG2)生長的抑制作用強(qiáng)于后者，但其對胰腺癌的作用如何尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，Midkine在癌旁胰腺組織中呈陰性表達(dá)，而在胰腺癌組織中多呈陽性表達(dá)。腫瘤越大、分化程度越低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越早，患者的生存期越短，Midkine表達(dá)越強(qiáng)，說明Midkine與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。術(shù)后通過對胰腺癌組織、特別是手術(shù)切緣的免疫組化Midkine檢測，有助于判斷胰腺癌的生物學(xué)行為及患者預(yù)后，對指導(dǎo)臨床開展多學(xué)科綜合治療具有一定實(shí)用價(jià)值。

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