曹 莉，熊正文，黃 勇，韓亞偉，蘇 紅，張華東，李 偉

研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的浸潤轉移是患者病死率較高的一個重要原因，上皮細胞－間質(zhì)轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和癌細胞脫離原發(fā)部位在浸潤轉移過程中起重要作用［1］。Snail和N-cadherin異常的表達是EMT發(fā)生的一個重要機制，增加了癌細胞的侵襲轉移性［2］。現(xiàn)探討Snail和N-cadherin在乳腺不同病變組織中的表達變化差異、與乳腺浸潤性導管癌臨床病理特征的關系以及它們的相關性，旨在探討其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和浸潤轉移中的作用。

1 資料與方法

1.1 標本來源 解放軍251醫(yī)院病理科于2008年1月—2009年12月收集乳腺普通型增生、乳腺導管內(nèi)癌組織標本各30例，乳腺浸潤性導管癌80例。乳腺普通型增生年齡28～56歲，中位數(shù)42歲。乳腺導管內(nèi)癌年齡30～62歲，中位數(shù)48歲;低級別癌8例，中級別癌15例，高級別癌7例，均無淋巴結轉移。乳腺浸潤性導管癌年齡22～75歲，中位數(shù)50歲;組織學分級Ⅰ～Ⅱ級55例，Ⅲ級25例;TNM分期Ⅰ～Ⅱ期26例，Ⅲ～Ⅳ期54例;有淋巴結轉移46例，無淋巴結轉移34例。術前均未接受化療、激素治療及放療。

1.2 主要試劑 兔抗人Snail多克隆抗體購自Abcom 公司(17732)，N-cadherin(MAB-0571)、免疫組化SP試劑盒及DAB顯色劑均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。

1.3 免疫組化染色(SP法) 標本均經(jīng)10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，采用0.01 mmol/L的枸櫞酸緩沖液抗原修復，染色程序按SP試劑盒說明書進行。以PBS代替一抗作陰性對照，已知陽性切片為陽性對照。

1.4 結果判定 Snail免疫組化陽性信號以胞核出現(xiàn)棕黃色為陽性細胞，按染色強度的深淺積分，0分:無染色，1分:弱陽性，2分:強陽性;按著色細胞百分比積分，1分:≤25%，2分:26% ～50%，3分:51% ～75%，4分:＞75%;按照陽性細胞×染色強弱計積分，積分1～2分為陰性，3～8分為陽性［3-4］。

N-cadherin陽性表達為細胞膜及細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，光鏡下每張切片隨機選取10個400倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞。陽性細胞數(shù)評分:陽性細胞數(shù)≤10%為0分，11% ～25%為1分，26% ～50%為2分，≥51%為3分。染色強度評分:無著色為0分，淡棕黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分。將兩項評分相乘，結果≤2分為陰性，＞2分為陽性。

1.5 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件處理，計數(shù)資料運用χ2檢驗、Spearman相關性檢驗分析，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 Snail、N-cadherin在不同乳腺病變中的表達乳腺浸潤性導管癌組織中，Snail陽性率為82.5%(66/80)，分別高于乳腺導管內(nèi)癌組織53.3%(16/30)和乳腺普通型增生組織13.3%(4/30)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.78，P ＜0.01 和 χ2=45.11，P ＜0.01);乳腺浸潤性導管癌組織中，N-cadherin陽性率為60.0%(48/80)，分別高于乳腺導管內(nèi)癌組織26.7%(8/30)和乳腺普通型增生組織10.0%(3/30)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.70，P ＜0.01 和χ2=12.97，P ＜0.01)，見圖1、2。

2.2 Snail、N-cadherin在乳腺浸潤性導管癌中表達與臨床病理指標的關系 Snail和N-cadherin在淋巴結轉移組中、TNM分期中Ⅲ～Ⅳ表達明顯較無淋巴結轉移組、TNM分期中Ⅰ～Ⅱ高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);Snail和N-cadherin與患者年齡、腫瘤直徑大小、組織學分級均無關(P＞0.05)，見表1。

圖1 Snail在不同乳腺病變中的陽性表達(SP×200)

圖2 N-cadherin在不同乳腺病變中的陽性表達(SP×200)

2.3 乳腺浸潤性導管癌組織中Snail、N-cadherin表達之間的關系 乳腺浸潤性導管癌中Snail和N-cadherin表達同時陽性者45例，同時陰性者11例，Snail陽性、N-cadherin陰性者21例，Snail陰性、N-cadherin陽性者3例，兩者呈顯著正相關(r=0.36，P＜0.01)。

3 討論

3.1 Snail、N-cadherin在乳腺不同病變組織中的表達情況 Snail首先被發(fā)現(xiàn)存在于果蠅中，是鋅指蛋白超家族的第一個成員，人Snail基因定位于第20號染色體 20q12.3，全長 5882 bp，包含 3個外顯子［5］。Snail與E-cadherin啟動子區(qū)的E盒(E-box)結合，抑制E-cadherin的表達，誘導EMT的發(fā)生［6］。本研究顯示Snail在乳腺浸潤性導管癌中的陽性表達率高于乳腺導管內(nèi)癌、乳腺普通型增生。N-cadherin是鈣黏附素家族中第一個在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的成員，其編碼基因定位于人染色體18ql1.2，分子量為127 kD，全長4132 bp，由906個氨基酸組成［7］。在成熟組織中，N-cadherin只表達在神經(jīng)外胚層和中胚層來源的組織，如成熟的神經(jīng)、肌肉和造血組織等。N-cadherin的表達有助于上皮細胞－間質(zhì)細胞的遷移，從而使腫瘤細胞更加富于侵襲力，易于轉移［8］。本研究顯示N-cadherin在乳腺浸潤性導管癌陽性表達率高于乳腺導管內(nèi)癌、乳腺單純性增生。提示Snail和N-cadherin蛋白在乳腺癌中的異常表達對其發(fā)生、發(fā)展可能起重要作用。

3.2 乳腺癌組織中Snail、N-cadherin的表達與臨床病理指標的關系 研究發(fā)現(xiàn)EMT在各種上皮細胞來源的惡性腫瘤的侵襲轉移過程中發(fā)揮了重要作用，而Snail可以誘導EMT的發(fā)生，因此Snail在腫瘤轉移中的作用越來越受到人們的關注。本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中Snail表達與年齡、腫瘤大小和組織學分級無關，與淋巴結轉移、TNM分期表達差異有統(tǒng)計學意義。結果提示，Snail高表達與乳腺癌發(fā)生、浸潤轉移密切相關，與Come等［9］的實驗結果基本一致。Snail在腫瘤中的表達越高，腫瘤的轉移能力可能也隨之增高，癌細胞更容易侵襲周圍組織并發(fā)生轉移，故其高表達可能提示預后不良。

本研究發(fā)現(xiàn)乳腺浸潤性導管癌組織中N-cadherin表達與年齡、腫瘤大小和組織學分級無關，與淋巴結轉移、TNM分期表達差異有統(tǒng)計學意義。提示隨著腫瘤轉移能力的增強，N-cadherin表達逐漸升高。N-cadherin的增加可以通過 FGFR激活MAP-KERK信號轉導途徑，誘導MMP-9基因表達，有利于腫瘤血管的形成，使腫瘤易于生長和轉移［10-11］。體外實驗也表明，給N-cadherin陰性表達的癌細胞轉染N-cadherin后，細胞的侵襲力明顯增強［12］。進一步說明 N-cadherin在乳腺癌浸潤和轉移過程中可能起著重要的作用，可以作為乳腺癌發(fā)生、發(fā)展以及浸潤轉移的指標。

表1 Snail、N-cadherin在乳腺浸潤性導管癌中表達與臨床病理指標的關系

3.3 乳腺浸潤性導管癌中Snail、N-cadherin表達的相關性 Snail與許多靶基因相互作用，而其中E-cadherin被認為是最重要的靶基因。Snail可與E-box結合，在轉錄水平上抑制E-cadherin的表達，誘導N-cadherin的高表達。隨著對經(jīng)典的cadherin分子深入研究發(fā)現(xiàn)，N-cadherin表達的增多，在引起腫瘤浸潤轉移方面有著比E-cadherin減少更為重要的作用，故在腫瘤的惡性生物學行為中，N-cadherin起著更重要的作用［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺浸潤性導管癌組織中Snail、N-cadherin表達變化一致上調(diào)，呈明顯正相關。因此，Snail可能間接導致N-cadherin的異常表達，從而導致上皮間連接的破壞，使癌細胞間黏附力減弱，更具有侵襲力。

綜上所述，乳腺浸潤性導管癌的浸潤轉移是多種因素共同作用的結果，其中Snail、N-cadherin的異常表達是一個主要因素，這兩種基因共同參與乳腺腫瘤的發(fā)展及轉移，它們可以共同作為判斷乳腺癌轉移和預后的參考指標。推測Snail可能作為轉錄因子，居于信號通路的中間環(huán)節(jié)，對其上游信號轉導通路以及下游Snail轉錄調(diào)控基因進行調(diào)控，并誘導N-cadherin的異常表達。因而通過阻斷Snail信號途徑，采取針對Snail的干預方案，有望降低乳腺浸潤性導管癌的浸潤轉移率，從而改善預后。

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