曹 莉，熊正文，黃 勇，韓亞偉，蘇 紅，張華東，李 偉

研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移是患者病死率較高的一個(gè)重要原因，上皮細(xì)胞－間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和癌細(xì)胞脫離原發(fā)部位在浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用［1］。Snail和N-cadherin異常的表達(dá)是EMT發(fā)生的一個(gè)重要機(jī)制，增加了癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移性［2］。現(xiàn)探討Snail和N-cadherin在乳腺不同病變組織中的表達(dá)變化差異、與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系以及它們的相關(guān)性，旨在探討其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 解放軍251醫(yī)院病理科于2008年1月—2009年12月收集乳腺普通型增生、乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌組織標(biāo)本各30例，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌80例。乳腺普通型增生年齡28～56歲，中位數(shù)42歲。乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌年齡30～62歲，中位數(shù)48歲;低級(jí)別癌8例，中級(jí)別癌15例，高級(jí)別癌7例，均無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌年齡22～75歲，中位數(shù)50歲;組織學(xué)分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)55例，Ⅲ級(jí)25例;TNM分期Ⅰ～Ⅱ期26例，Ⅲ～Ⅳ期54例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例。術(shù)前均未接受化療、激素治療及放療。

1.2 主要試劑 兔抗人Snail多克隆抗體購(gòu)自Abcom 公司(17732)，N-cadherin(MAB-0571)、免疫組化SP試劑盒及DAB顯色劑均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 免疫組化染色(SP法) 標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，采用0.01 mmol/L的枸櫞酸緩沖液抗原修復(fù)，染色程序按SP試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性切片為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 Snail免疫組化陽(yáng)性信號(hào)以胞核出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，按染色強(qiáng)度的深淺積分，0分:無(wú)染色，1分:弱陽(yáng)性，2分:強(qiáng)陽(yáng)性;按著色細(xì)胞百分比積分，1分:≤25%，2分:26% ～50%，3分:51% ～75%，4分:＞75%;按照陽(yáng)性細(xì)胞×染色強(qiáng)弱計(jì)積分，積分1～2分為陰性，3～8分為陽(yáng)性［3-4］。

N-cadherin陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，光鏡下每張切片隨機(jī)選取10個(gè)400倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)分:陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為0分，11% ～25%為1分，26% ～50%為2分，≥51%為3分。染色強(qiáng)度評(píng)分:無(wú)著色為0分，淡棕黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分。將兩項(xiàng)評(píng)分相乘，結(jié)果≤2分為陰性，＞2分為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，計(jì)數(shù)資料運(yùn)用χ2檢驗(yàn)、Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)分析，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 Snail、N-cadherin在不同乳腺病變中的表達(dá)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中，Snail陽(yáng)性率為82.5%(66/80)，分別高于乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌組織53.3%(16/30)和乳腺普通型增生組織13.3%(4/30)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.78，P ＜0.01 和 χ2=45.11，P ＜0.01);乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中，N-cadherin陽(yáng)性率為60.0%(48/80)，分別高于乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌組織26.7%(8/30)和乳腺普通型增生組織10.0%(3/30)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.70，P ＜0.01 和χ2=12.97，P ＜0.01)，見(jiàn)圖1、2。

2.2 Snail、N-cadherin在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 Snail和N-cadherin在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中、TNM分期中Ⅲ～Ⅳ表達(dá)明顯較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、TNM分期中Ⅰ～Ⅱ高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);Snail和N-cadherin與患者年齡、腫瘤直徑大小、組織學(xué)分級(jí)均無(wú)關(guān)(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

圖1 Snail在不同乳腺病變中的陽(yáng)性表達(dá)(SP×200)

圖2 N-cadherin在不同乳腺病變中的陽(yáng)性表達(dá)(SP×200)

2.3 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中Snail、N-cadherin表達(dá)之間的關(guān)系 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中Snail和N-cadherin表達(dá)同時(shí)陽(yáng)性者45例，同時(shí)陰性者11例，Snail陽(yáng)性、N-cadherin陰性者21例，Snail陰性、N-cadherin陽(yáng)性者3例，兩者呈顯著正相關(guān)(r=0.36，P＜0.01)。

3 討論

3.1 Snail、N-cadherin在乳腺不同病變組織中的表達(dá)情況 Snail首先被發(fā)現(xiàn)存在于果蠅中，是鋅指蛋白超家族的第一個(gè)成員，人Snail基因定位于第20號(hào)染色體 20q12.3，全長(zhǎng) 5882 bp，包含 3個(gè)外顯子［5］。Snail與E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)的E盒(E-box)結(jié)合，抑制E-cadherin的表達(dá)，誘導(dǎo)EMT的發(fā)生［6］。本研究顯示Snail在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的陽(yáng)性表達(dá)率高于乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌、乳腺普通型增生。N-cadherin是鈣黏附素家族中第一個(gè)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的成員，其編碼基因定位于人染色體18ql1.2，分子量為127 kD，全長(zhǎng)4132 bp，由906個(gè)氨基酸組成［7］。在成熟組織中，N-cadherin只表達(dá)在神經(jīng)外胚層和中胚層來(lái)源的組織，如成熟的神經(jīng)、肌肉和造血組織等。N-cadherin的表達(dá)有助于上皮細(xì)胞－間質(zhì)細(xì)胞的遷移，從而使腫瘤細(xì)胞更加富于侵襲力，易于轉(zhuǎn)移［8］。本研究顯示N-cadherin在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌陽(yáng)性表達(dá)率高于乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌、乳腺單純性增生。提示Snail和N-cadherin蛋白在乳腺癌中的異常表達(dá)對(duì)其發(fā)生、發(fā)展可能起重要作用。

3.2 乳腺癌組織中Snail、N-cadherin的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 研究發(fā)現(xiàn)EMT在各種上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，而Snail可以誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，因此Snail在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用越來(lái)越受到人們的關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中Snail表達(dá)與年齡、腫瘤大小和組織學(xué)分級(jí)無(wú)關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示，Snail高表達(dá)與乳腺癌發(fā)生、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與Come等［9］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。Snail在腫瘤中的表達(dá)越高，腫瘤的轉(zhuǎn)移能力可能也隨之增高，癌細(xì)胞更容易侵襲周?chē)M織并發(fā)生轉(zhuǎn)移，故其高表達(dá)可能提示預(yù)后不良。

本研究發(fā)現(xiàn)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中N-cadherin表達(dá)與年齡、腫瘤大小和組織學(xué)分級(jí)無(wú)關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示隨著腫瘤轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)，N-cadherin表達(dá)逐漸升高。N-cadherin的增加可以通過(guò) FGFR激活MAP-KERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)MMP-9基因表達(dá)，有利于腫瘤血管的形成，使腫瘤易于生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［10-11］。體外實(shí)驗(yàn)也表明，給N-cadherin陰性表達(dá)的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染N-cadherin后，細(xì)胞的侵襲力明顯增強(qiáng)［12］。進(jìn)一步說(shuō)明 N-cadherin在乳腺癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能起著重要的作用，可以作為乳腺癌發(fā)生、發(fā)展以及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。

表1 Snail、N-cadherin在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

3.3 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中Snail、N-cadherin表達(dá)的相關(guān)性 Snail與許多靶基因相互作用，而其中E-cadherin被認(rèn)為是最重要的靶基因。Snail可與E-box結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平上抑制E-cadherin的表達(dá)，誘導(dǎo)N-cadherin的高表達(dá)。隨著對(duì)經(jīng)典的cadherin分子深入研究發(fā)現(xiàn)，N-cadherin表達(dá)的增多，在引起腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移方面有著比E-cadherin減少更為重要的作用，故在腫瘤的惡性生物學(xué)行為中，N-cadherin起著更重要的作用［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中Snail、N-cadherin表達(dá)變化一致上調(diào)，呈明顯正相關(guān)。因此，Snail可能間接導(dǎo)致N-cadherin的異常表達(dá)，從而導(dǎo)致上皮間連接的破壞，使癌細(xì)胞間黏附力減弱，更具有侵襲力。

綜上所述，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移是多種因素共同作用的結(jié)果，其中Snail、N-cadherin的異常表達(dá)是一個(gè)主要因素，這兩種基因共同參與乳腺腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移，它們可以共同作為判斷乳腺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的參考指標(biāo)。推測(cè)Snail可能作為轉(zhuǎn)錄因子，居于信號(hào)通路的中間環(huán)節(jié)，對(duì)其上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及下游Snail轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因進(jìn)行調(diào)控，并誘導(dǎo)N-cadherin的異常表達(dá)。因而通過(guò)阻斷Snail信號(hào)途徑，采取針對(duì)Snail的干預(yù)方案，有望降低乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移率，從而改善預(yù)后。

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