張穎倩，胡舜英，陳韻岱

血管內皮細胞作為血管最內層細胞，直接接觸血液，具有保持血管的完整性與穩(wěn)定性，抗血小板聚集、維持血管張力等生理功能。心肌微血管內皮細胞(cardiac microvascular endothelial cells，CMECs)與大血管內皮細胞及各臟器微血管內皮細胞之間表現出不同的功能異質性［1］。CMECs可通過分泌活性物質直接影響心肌細胞［2］，并參與缺血/再灌注損傷［3］、無復流現象等病理生理過程。原代CMECs的分離培養(yǎng)對研究缺血/再灌注損傷、微血管功能障礙、冠心病的治療等有重要意義。本實驗在Peters實驗［4］的基礎上進行了改進，在保證細胞純度的前提下進一步提高了CMECs的收獲率，成功分離并培養(yǎng)了純度、成活率均較高的原代CMECs。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(Heraeus)，超凈臺(北京亞泰科隆)，酶標儀(Biotec)，搖床(北京歐諾)，倒置熒光顯微鏡(Olympus)，流式細胞儀(B＆D)。

1.2 實驗動物與試劑 SD大鼠乳鼠，5～7 d，體重12～15 g，雌雄不限，購自解放軍總醫(yī)院實驗動物中心，動物許可證編號:SCXK(京)2012-0001。高糖DMEM干粉(Gibco)，Ⅰ型膠原酶(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，0.25%胰蛋白酶(Hyclone)，PBS(Hyclone)，四甲基偶氮唑鹽(MTT，Hyclone)，重組人血管內皮生長因子(VEGF，中科物源)，兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗體(中杉金橋)，兔抗鼠CD31多克隆抗體(中杉金橋)，FITC標記的山羊抗兔IgG(中杉金橋)，AnnexinⅤ-FITC＆PI凋亡檢測試劑盒(嘉美生物)，二甲基亞砜(DMSO，Gibco)。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳鼠CMECs的分離與培養(yǎng):乳鼠脫臼處死，無菌條件下取左心室，放入冰浴PBS+肝素鈉溶液中，眼科剪和眼科鑷去除左心室外1/4層組織、心內膜、心外膜及瓣膜。沿室間隔剪開左心室，95%乙醇浸泡20 s，滅活殘余的心內膜和心外膜細胞。PBS沖洗，將心肌組織剪為 0.5 mm ×0.5 mm ×0.5 mm的組織塊。加0.2%Ⅰ型膠原酶5 ml，置于搖床內37℃振蕩水浴20 min，吹打后加入0.25%胰酶5 ml，37℃振蕩水浴5 min，再次吹打。200目金屬篩網過濾，濾液用等體積基礎培養(yǎng)基(90%DMEM+10%胎牛血清)中和，1000 r/min離心8 min。棄上清收集沉淀細胞，細胞重懸于培養(yǎng)液中，接種于培養(yǎng)瓶內，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后，去除懸浮的未貼壁細胞，加入完全培養(yǎng)基(80%DMEM+20%胎牛血清+10 ng/ml VEGF+100 U/ml青霉素+100 U/ml鏈霉素)繼續(xù)培養(yǎng)已貼壁的CMECs。48 h更換一次完全培養(yǎng)基。細胞生長覆蓋80%培養(yǎng)面時，0.25%胰酶消化，按1∶2比例傳代。

1.3.2 細胞免疫組化染色進行細胞鑒定:將蓋玻片平放于24孔板中，細胞懸液調整至1×105個/ml滴加于蓋玻片上，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長覆蓋80%培養(yǎng)面后，取出細胞爬片;PBS洗3次，每次5 min;4%多聚甲醛固定20 min;PBS洗3次，每次5 min;5%牛白蛋白室溫封閉30 min;分別在兩張細胞爬片上滴加兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗體(1:100)和兔抗鼠CD31多克隆抗體(1:100)，陰性對照細胞爬片滴加等量PBS，放入濕盒內，37℃孵育4 h;PBS洗3次，每次5 min;于3張細胞爬片上分別滴加山羊抗兔IgG-FITC，37℃避光孵育30 min;PBS洗3次，每次5 min［5］。立即于倒置熒光顯微鏡下觀察，每張爬片計數10個視野，計算其平均數。

1.3.3 臺盼藍染色測定細胞存活率及AnnexinⅤ＆PI雙標記流式細胞術檢測細胞凋亡率:細胞生長覆蓋80%培養(yǎng)面時，0.25%胰酶消化，用等體積基礎培養(yǎng)基(90%DMEM+10%胎牛血清)中和，1000 r/min離心8 min。棄上清收集沉淀細胞，細胞重懸于培養(yǎng)基中，并吹打均勻。90 μl細胞懸液與10 μl 0.4%臺盼藍染液混勻，染色3 min，于倒置相差顯微鏡下觀察，死細胞染成藍色，活細胞呈無色透明狀［6］。統(tǒng)計細胞活力:活細胞率(%)=活細胞數/(活細胞數+死細胞數)×100%。重復3次，取其平均值。細胞生長覆蓋80%培養(yǎng)面時，0.25%胰酶消化，用等體積基礎培養(yǎng)基中和，1000 r/min離心8 min。棄上清收集(1～5)×105細胞，用預冷PBS(4℃)重懸細胞，1000 r/min離心5 min，棄上清，加500 μl Binding buffer 重懸，加入 5 μl AnnexinⅤ-FITC染液混勻并避光，室溫孵育15 min;加入5 μl PI染色5 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率及存活率［7］。重復3次，取其平均值。

1.3.4 MTT法繪制細胞生長曲線:細胞按104/孔接種于 96孔板中培養(yǎng) 24 h，向4復孔中加入5 mg/ml MTT 溶液 10 μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng) 4 h;棄掉培養(yǎng)基，每孔加入 150 μl DMSO，避光振蕩 10 min，于酶標儀570 nm波長處檢測光吸收值［8］。每24 h測定4復孔的光吸收值。計算每個復孔吸光度平均值并繪制細胞生長曲線。

2 結果

2.1 CMECs培養(yǎng)結果細胞貼壁培養(yǎng)4 h后棄去上清，PBS沖洗后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，可見細胞貼壁生長。原代乳鼠CMECs培養(yǎng)24 h可見短梭形、三角形、多邊形細胞聚集呈管腔樣生長。72 h見原代培養(yǎng)乳鼠CMECs鋪滿，呈鋪路石樣，見圖1。鋪路石樣及管腔樣生長皆為血管內皮細胞的典型生長特點。

圖1 光鏡觀察乳鼠心肌微血管內皮細胞培養(yǎng)結果(×40)

2.2 CMECs鑒定結果 在倒置熒光顯微鏡下觀察，兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗體免疫熒光染色后，胞漿內呈綠色熒光，見圖2。兔抗鼠CD31多克隆抗體免疫熒光染色后，胞膜呈綠色熒光，見圖3。陰性對照細胞不能觀察到熒光。Ⅷ因子及CD31雙陽性證實為微血管內皮細胞，雙陽性者＞95%。分離培養(yǎng)的乳鼠CMECs純度很高。

2.3 CMECs臺盼藍染色及AnnexinⅤ＆PI雙標記流式細胞術結果 臺盼藍染色后進行細胞計數，重復3次，計數活細胞率平均值＞95%，25 cm2培養(yǎng)瓶細胞數達7×106/瓶。AnnexinⅤ＆PI雙標記流式細胞術檢測存活細胞率＞95%，見圖4。

圖2 乳鼠心肌微血管內皮細胞(兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗體免疫熒光染色×200)圖3 乳鼠心肌微血管內皮細胞(兔抗鼠CD31多克隆抗體免疫熒光染色×200)

圖4 AnnexinⅤ-FITC＆PI染色流式細胞術檢測細胞存活率

2.4 CMECs生長曲線 MTT法連續(xù)11 d檢測細胞增殖情況，并繪制細胞生長曲線，見圖5。于培養(yǎng)3～5 d進入對數生長期，培養(yǎng) 5～7 d為生長平臺期。

圖5 乳鼠心肌微血管內皮細胞生長曲線

3 討論

目前，培養(yǎng)原代CMECs的方法主要有磁珠篩選法［9］、植塊培養(yǎng)法［10-12］和雙酶消化法［4，13］。磁珠篩選法對儀器、技術要求較高，需要連接有抗體的磁珠，成本高且細胞收獲率低。植塊培養(yǎng)法分離操作較簡單，對實驗條件無特殊要求，分離細胞成本低，但培養(yǎng)時間長，原代細胞生長覆蓋80%培養(yǎng)面需5 ～7 d，且培養(yǎng)皿需用鼠尾膠原［14］或明膠［15］等處理以促進血管內皮細胞的爬出與貼壁，增加了操作步驟及污染概率。Peters等［4］采用雙酶消化法分離并純化原代微血管內皮細胞，并通過物理法、化學法、差速貼壁法純化內皮細胞，可在較短時間內獲得純度較高的原代微血管內皮細胞。心臟組織的內皮細胞分為大血管壁內皮細胞，微血管內皮細胞和心內膜、心外膜內皮細胞，三者在功能與結構上均存在著異質性［16-17］。為了得到高純度的 CMECs，心內膜、心外膜內皮細胞和大血管壁內皮細胞是必須去除的。在Peters的實驗中，剪除心房、瓣膜、右心室、室間隔、心內膜以去除心內膜、心外膜內皮細胞;剪除左心室外1/4層心肌以去除心外膜及大血管內皮細胞。將剩余組織于95%乙醇中處理，進一步滅活剩余的心內膜和心外膜內皮細胞。使用膠原酶孵育使心臟組織松散，吹打過程促進了內皮細胞與成纖維細胞、心肌細胞的分離。胰酶與膠原酶共同孵育消化，能促進破壞成纖維細胞。并根據內皮細胞貼壁較心肌細胞貼壁快的原理，在內皮細胞大量貼壁后，去除上清并用預熱的PBS沖洗，將貼壁的細胞繼續(xù)培養(yǎng)，利用差速貼壁法純化微血管內皮細胞。

本實驗在Peters實驗的基礎上進一步改進了實驗步驟:①選用5～7 d齡的SD乳鼠，細胞的增殖分裂能力較3月齡的大鼠細胞強。雖然對心臟的解剖及心房、瓣膜、右心室、室間隔、心內膜及左心室外1/4層心肌的去除操作要求較高，但練習后可以較好完成。②將其實驗中膠原酶的孵育時間自10 min延長至20 min，并置于180 g/min、37℃的搖床孵育，增加了組織塊與膠原酶的接觸時間與面積，進一步促進了內皮細胞與非內皮細胞的分離。③將初次分離的細胞懸液培養(yǎng)時間自1 h延長至4 h后去除上清，增加了貼壁的細胞數量。且經Ⅷ因子及CD31雙鑒定純度＞95%，在保證純度的前提下提高了CMECS的收獲率。④有研究指出，心肌成纖維細胞的分裂增殖速度較微血管內皮細胞快［18］，故于培養(yǎng)基中加入10 ng/ml VEGF促進微血管內皮細胞的生長，可對成纖維細胞生長造成抑制，以提高微血管內皮細胞的純度。⑤成纖維細胞貼壁較微血管內皮細胞牢固，在傳代過程中，采用差速消化法，于0.25%胰酶消化2 min時及時終止消化，可以進一步去除貼壁較牢的成纖維細胞。本實驗成功分離并培養(yǎng)了純度、成活率均較高的原代CMECs，為缺血/再灌注損傷、微血管功能障礙、冠心病相關治療等的體外研究提供了良好的實驗基礎。

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