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        阿托伐他汀抑制老年大鼠心肌白細(xì)胞介素-1β表達(dá)機(jī)制研究

        2013-09-14 05:40:34李鳴皋
        解放軍醫(yī)藥雜志 2013年9期
        關(guān)鍵詞:汀組空白對照阿托

        韓 磊,葉 平,李鳴皋

        隨著社會逐漸向老齡化發(fā)展,衰老的機(jī)制及防護(hù)也成為廣大學(xué)者研究的熱點。研究表明[1-4],他汀類藥物作為臨床應(yīng)用最廣泛的調(diào)脂藥物,還有許多調(diào)脂之外的作用,如抗炎、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、逆轉(zhuǎn)左室重構(gòu)、抑制動脈粥樣硬化等。本研究以培養(yǎng)老年大鼠心肌細(xì)胞為研究對象,觀察阿托伐他汀抑制老年大鼠心肌細(xì)胞炎性因子白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)表達(dá)的作用與過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ,PPARγ)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)系,為研究心臟衰老的病理生理機(jī)制及其防治措施進(jìn)行初步探索。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑 Wister大鼠(北京維通利華公司),阿托伐他汀(大連輝瑞制藥公司,批號:75837005),Ⅰ型膠原酶(Sigma公司),胰蛋白酶(Sigma公司),DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司),二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液(Sigma公司),小牛血清(Gibco公司),GW9662(Sigma公司),RTPCR試劑盒(Takara公司),羊抗鼠 IL-1β一抗(美國Santa cruz公司),羊抗鼠GAPDH一抗(美國San-ta cruz公司),HRP兔抗羊二抗(美國Santa cruz公司),超敏發(fā)光液(北京普利來公司),CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司HEPA class 100型),超凈工作臺(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠),倒置顯微鏡(Olympus),PCR儀(美國Bio-Rad公司2720型),垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司Power PacTMBasic),核酸分析儀(美國Beckman公司DU-640型),臺式冷凍高速離心機(jī)(美國Beckman公司),全自動凝膠分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司Gel Doc 2000型)。

        1.2 老年大鼠原代心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng) 30只10月齡的Wister大鼠,雌雄各半,飼養(yǎng)至24月齡時作為實驗對象,體重(637.3±60.1)g。以2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠,常規(guī)消毒后,剪開大鼠胸腔,迅速取出心臟并分離左室心肌。將心肌組織剪成1 mm3大小的組織塊后,以0.1%胰蛋白酶和0.1%的Ⅰ型膠原酶消化心肌組織。消化下來的細(xì)胞懸液以80目篩網(wǎng)過濾,在室溫下離心后,收集細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)液重懸,調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105/ml。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中,以差速貼壁法去除非心肌細(xì)胞后,將心肌細(xì)胞移至新培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

        1.3 實驗分組及處理 分別以DMSO溶解阿托伐他汀和GW9662。將培養(yǎng)的老年大鼠心肌細(xì)胞編號后隨機(jī)分為4組,每組10只。即阿托伐他汀組、阿托伐他汀+GW9662組、溶劑對照組、空白對照組。各組分別給予以下處理:①阿托伐他汀組:加入配制好的阿托伐他汀溶液,使培養(yǎng)液中阿托伐他汀的濃度為10 μmol/L,置于培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)12 h;②阿托伐他汀+GW9662組:加入PPARγ拮抗劑GW9662溶液,使其在培養(yǎng)液中的濃度為5 μmol/L,培養(yǎng)0.5 h后,再加入阿托伐他汀溶液,使其在培養(yǎng)液中的濃度為10 μmol/L,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h;③溶劑對照組:細(xì)胞培養(yǎng)液中加入等體積的DMSO溶液,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h;④空白對照組:加入等體積DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

        1.4 RT-PCR方法檢測各組心肌細(xì)胞IL-1β mRNA表達(dá)水平

        1.4.1 引物合成:由賽百盛生物技術(shù)公司合成,序列見表1。

        表1 合成引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物分子量

        1.4.2 RT-PCR反應(yīng):以TRIzol一步法提取各組老年大鼠心肌細(xì)胞的總RNA。嚴(yán)格按RT-PCR試劑盒的程序操作:①將各樣本的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,反應(yīng)條件為:42℃、30 min→99℃、5 min→5℃、5 min;②分別用相應(yīng)的引物擴(kuò)增IL-1β及GAPDH。其中,IL-1β 的PCR 反應(yīng)條件為:95℃、5 min,94℃、45 s→50℃、1 min →72℃、1 min(33個循環(huán)),72℃、8 min;③PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后,在圖像分析儀下掃描,以IL-1β與GAPDH的光密度之比作為IL-1β mRNA的相對表達(dá)量。

        1.5 Western bolt方法測定各組IL-1β蛋白含量按照以下步驟進(jìn)行:①樣本細(xì)胞用4℃的PBS洗滌3次;②加入單去污裂解液,冰上裂解30 min;③取裂解液,4℃下12 000 g離心5 min;④吸取上清液,加入loading buffer后煮5 min,置于-80℃冰箱備用;⑤另取少量上清液,用核酸分析儀測定其蛋白濃度,計算各樣品的上樣量;⑥各樣本根據(jù)上樣量進(jìn)行上樣,60 V電壓下進(jìn)行垂直電泳和轉(zhuǎn)膜;⑦5%脫脂奶粉封閉1 h,膜入羊抗鼠一抗中,4℃過夜;⑧洗膜后加入兔抗羊二抗,室溫下孵育2 h;⑨洗膜后加入發(fā)光液,于暗室中進(jìn)行曝光反應(yīng)。用圖像分析軟件進(jìn)行分析,將IL-1β條帶與GAPDH灰度值與面積的乘積之比,作為其IL-1β蛋白的相對含量。

        1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包處理,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用單因素方差分析,α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

        2 結(jié)果

        2.1 心肌細(xì)胞的培養(yǎng) 老年大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)成功,在顯微鏡下,心肌細(xì)胞多表現(xiàn)為桿狀或者矩形,表面有清晰的橫紋,少量的心肌細(xì)胞呈現(xiàn)為類圓形,見圖1。

        圖1 老年大鼠心肌細(xì)胞(×400)

        2.2 心肌細(xì)胞IL-1β mRNA及IL-1β蛋白含量的比較 各組IL-1β mRNA表達(dá)水平、IL-1β蛋白含量見圖2、3及表2。與空白對照組相比,溶劑對照組大鼠心肌細(xì)胞的IL-1β mRNA表達(dá)水平及IL-1β蛋白含量均無顯著差異(P>0.05);阿托伐他汀組IL-1β mRNA表達(dá)水平及IL-1β蛋白含量均低于空白對照組、溶劑對照組(P<0.01);阿托伐他汀 +GW9662組的IL-1β mRNA表達(dá)水平及IL-1β蛋白含量均高于阿托伐他汀組(P<0.05),但仍顯著低于空白對照組、溶劑對照組(P<0.05或P<0.01)。

        圖2 老年大鼠心肌細(xì)胞IL-1β mRNA RT-PCR結(jié)果

        圖3 老年大鼠心肌細(xì)胞IL-1β蛋白含量電泳結(jié)果

        表2 各組大鼠心肌細(xì)胞IL-1β mRNA及IL-1β蛋白含量的比較(±s)

        表2 各組大鼠心肌細(xì)胞IL-1β mRNA及IL-1β蛋白含量的比較(±s)

        注:IL-1β mRNA表達(dá)水平為IL-1β與GAPDH光密度之比,IL-1β蛋白含量為IL-1β與GAPDH灰度值之比。與空白對照組比較,aP<0.05,bP<0.01;與溶劑對照組比較,cP <0.05,dP <0.01;與阿托伐他汀組比較,eP<0.05

        組別 鼠數(shù)IL-1β mRNA表達(dá)水平IL-1β蛋白含量阿托伐他汀組 10 0.439 ±0.096bd0.233 ±0.062bd 10 0.726 ±0.132 0.604 ±0.123阿托伐他汀+GW9662組 10 0.568 ±0.104ace0.348 ±0.114bde空白對照組 10 0.698 ±0.119 0.570 ±0.121溶劑對照組

        3 討論

        近年來,心肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)正日漸成為研究心臟結(jié)構(gòu)、功能與心血管疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的重要手段[5-7]。受技術(shù)水平的限制,國內(nèi)多數(shù)情況下是用乳鼠的心肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),鮮見以衰老心肌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)來開展研究的報道。然而,乳鼠的心肌細(xì)胞在代謝和功能方面畢竟不同于衰老心肌細(xì)胞,為準(zhǔn)確反應(yīng)衰老心肌的特點及對干預(yù)因素的反應(yīng),特進(jìn)行了研究。

        本研究中,阿托伐他汀組心肌細(xì)胞的IL-1β表達(dá)水平顯著低于空白對照組,提示阿托伐他汀有著顯著的抗炎作用,這同以往的研究是一致的。本研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀在自然衰老的生理條件下,也具有抗炎等保護(hù)作用。既往研究表明,炎癥因素在心臟衰老的病理生理過程中起著重要的作用,心肌細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子后,可直接導(dǎo)致心臟的衰老性改變[8-10]。如炎癥因子可與活性氧協(xié)同促進(jìn)和誘導(dǎo)心血管系統(tǒng)的衰老[11];炎癥因子在體內(nèi)的含量隨年齡增加而增多,其可通過多條通路介導(dǎo)機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài),進(jìn)而導(dǎo)致心血管系統(tǒng)的老化[12]。因此,在自然衰老狀態(tài)下,阿托伐他汀抑制炎癥因子表達(dá),提示其可能具有抑制心肌老化改變的作用。

        已有的研究證實,阿托伐他汀干預(yù)可抑制IL-1β 等炎性因子的表達(dá)[13-14],還可顯著上調(diào) PPARγ的表達(dá)水平[15]。為明確究竟是阿托伐他汀使得PPARγ信號通路激活,進(jìn)而抑制了IL-1β等炎性因子的表達(dá),還是阿托伐他汀先抑制了炎性因子IL-1β的表達(dá),進(jìn)而激活了PPARγ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,本研究采用PPARγ拮抗劑GW9662來阻斷PPARγ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,然后觀察阿托伐他汀抑制IL-1β表達(dá)的作用有無受到影響。結(jié)果顯示,給予GW9662阻斷PPARγ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑后,衰老心肌中IL-1β的表達(dá)顯著增強(qiáng)。這一結(jié)果提示,通過阻斷PPARγ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,可部分抑制阿托伐他汀的抗炎作用。這也進(jìn)一步提示阿托伐他汀使得PPARγ信號通路激活,進(jìn)而抑制了IL-1β等炎性因子的表達(dá)。但在現(xiàn)階段,阿托伐他汀是如何通過PPARγ信號通路來進(jìn)抑制炎性因子IL-1β表達(dá)機(jī)制尚不清楚。

        我們在研究中還發(fā)現(xiàn),阿托伐他汀+GW9662組的IL-1β的表達(dá)水平雖高于阿托伐他汀組,但仍明顯低于空白對照組。這一結(jié)果提示,雖然通過GW9662阻斷了PPARγ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,阿托伐他汀抑制IL-1β表達(dá)的作用仍未被完全阻斷。這也進(jìn)一步提示,激活PPARγ信號通路僅是阿托伐他汀抗炎作用的重要途徑之一,但并不是唯一的途徑。究竟在PPARγ信號通路以外,還存在哪些信號通路來介導(dǎo)阿托伐他汀抑制衰老心肌細(xì)胞中炎性因子表達(dá)的作用,目前尚不十分清楚,需要進(jìn)一步加以研究。

        [1]Jaiswal S R,Sontakke S D.Experimental evaluation of analgesic and anti-inflammatory activity of simvastatin and atorvastatin[J].Indian J Pharmacol,2012,44(4):475-479.

        [2]Kotlega D,Ciecwiez S,Turowska K J,et al.Pathogenetic justification of statin use in ischaemic stroke prevention ac-cording to inflammatory theory in development of atherosclerosis[J].Neurol Neurochir Pol,2012,46(2):176-183.

        [3]Yao J,Xiong M,Tang B,et al.Simvastatin attenuates pulmonary vascular remodelling by down-regulating matrix metalloproteinase-1 and 9 expression in a carotid artery-jugular vein shunt pulmonary hypertension model in rats[J].Eur J Cardiothorac Surg,2012,42(5):121-127.

        [4]Rohilla A,Khan M U,Khanam R.Cardioprotective potential of simvastatin in the hyperhomocysteinemic rat heart[J].J Adv Pharm Technol Res,2012,3(3):193-198.

        [5]Yu J Z,Bondy G P,Allard M F,et al.Serum from patients with chronic renal insufficiency alters growth characteristics and ANP mRNA expression of adult rat cardiac myocytes[J].J Mol Cell Cardiol,1996,28(12):2429-2441.

        [6]Schluter K D,Goldberg Y,Taimor G,et al.Role of phosphatidylinositol 3-kinase activation in the hypertrophic growth of adult ventricular cardiomyocytes[J].Cardiovasc Res,1998,40(1):174-181.

        [7]Clark W A,Decker M L,Behnke B M,et al.Cell contact as an independent factor modulating cardiac myocytes hypertrophy and survival in longterm primary culture[J].J Mol Cell Cardiol,1998,30(1):139-155.

        [8]Chung H Y,Sung B,Jung K J,et al.The molecular inflammatory process in aging[J].Antioxid redox signal,2006,8(3-4):572-581.

        [9]de Gonzalo C D,Neitzert K,F(xiàn)ernández M,et al.Differential inflammatory responses in aging and disease:TNF-alpha and IL-6 as possible biomarkers[J].Free Radic Biol Med,2010,49(5):733-737.

        [10]Krieglstein K,Miyazono K,Dijke P,et al.TGF-β in aging and disease[J].Cell Tissue Res,2012,347(1):5-9.

        [11]Sung B,Park S,Yu B P,et al.Amelioration of age related inflammation and oxidative stress by PPARγ activator:Suppression of NF-κB by 2,4-thiazolinedione[J].Exp Gerontol,2006,41(6):590-599.

        [12]Domenighetti A A,Wang Q,Egger M,et al.AngiotensinⅡ-mediated phenotypic cardiomyocyte remodeling leads to age-dependent cardiac dysfunction and failure[J].Hypertrophy,2005,46(2):426-432.

        [13]Sun T W,Zhang J Y,Li L,et al.Effect atorvastatin on serum tumor necrosis factor alpha and interleukin-1β following acute pulmonary embolism[J].Exp Lung Res,2011,37(2):78-81.

        [14]Sun Y M,Tian Y,Li X,et al.Effect of atorvastatin on expression of IL-10 and TNF-alpha mRNA in myocardial ischemia-reperfusion injury in rats[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,382(2):336-340.

        [15]Yang P,Li Y,Li J J,et al.Up-regulating PPAR-γ expression and NO concentration,and down-regulating PAI-1 concentration in a rabbit atherosclerotic model:the possible antiatherogenic and antithrombotic effects of atorvastatin[J].Int J Cardiol,2005,139(3):213-217.

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