韓 磊，葉 平，李鳴皋

隨著社會(huì)逐漸向老齡化發(fā)展，衰老的機(jī)制及防護(hù)也成為廣大學(xué)者研究的熱點(diǎn)。研究表明［1-4］，他汀類藥物作為臨床應(yīng)用最廣泛的調(diào)脂藥物，還有許多調(diào)脂之外的作用，如抗炎、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、逆轉(zhuǎn)左室重構(gòu)、抑制動(dòng)脈粥樣硬化等。本研究以培養(yǎng)老年大鼠心肌細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察阿托伐他汀抑制老年大鼠心肌細(xì)胞炎性因子白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)表達(dá)的作用與過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)系，為研究心臟衰老的病理生理機(jī)制及其防治措施進(jìn)行初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 Wister大鼠(北京維通利華公司)，阿托伐他汀(大連輝瑞制藥公司，批號(hào):75837005)，Ⅰ型膠原酶(Sigma公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液(Sigma公司)，小牛血清(Gibco公司)，GW9662(Sigma公司)，RTPCR試劑盒(Takara公司)，羊抗鼠 IL-1β一抗(美國(guó)Santa cruz公司)，羊抗鼠GAPDH一抗(美國(guó)San-ta cruz公司)，HRP兔抗羊二抗(美國(guó)Santa cruz公司)，超敏發(fā)光液(北京普利來(lái)公司)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司HEPA class 100型)，超凈工作臺(tái)(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠)，倒置顯微鏡(Olympus)，PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司2720型)，垂直電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司Power PacTMBasic)，核酸分析儀(美國(guó)Beckman公司DU-640型)，臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)，全自動(dòng)凝膠分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司Gel Doc 2000型)。

1.2 老年大鼠原代心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng) 30只10月齡的Wister大鼠，雌雄各半，飼養(yǎng)至24月齡時(shí)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，體重(637.3±60.1)g。以2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠，常規(guī)消毒后，剪開(kāi)大鼠胸腔，迅速取出心臟并分離左室心肌。將心肌組織剪成1 mm3大小的組織塊后，以0.1%胰蛋白酶和0.1%的Ⅰ型膠原酶消化心肌組織。消化下來(lái)的細(xì)胞懸液以80目篩網(wǎng)過(guò)濾，在室溫下離心后，收集細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105/ml。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，以差速貼壁法去除非心肌細(xì)胞后，將心肌細(xì)胞移至新培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 分別以DMSO溶解阿托伐他汀和GW9662。將培養(yǎng)的老年大鼠心肌細(xì)胞編號(hào)后隨機(jī)分為4組，每組10只。即阿托伐他汀組、阿托伐他汀+GW9662組、溶劑對(duì)照組、空白對(duì)照組。各組分別給予以下處理:①阿托伐他汀組:加入配制好的阿托伐他汀溶液，使培養(yǎng)液中阿托伐他汀的濃度為10 μmol/L，置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12 h;②阿托伐他汀+GW9662組:加入PPARγ拮抗劑GW9662溶液，使其在培養(yǎng)液中的濃度為5 μmol/L，培養(yǎng)0.5 h后，再加入阿托伐他汀溶液，使其在培養(yǎng)液中的濃度為10 μmol/L，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h;③溶劑對(duì)照組:細(xì)胞培養(yǎng)液中加入等體積的DMSO溶液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h;④空白對(duì)照組:加入等體積DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

1.4 RT-PCR方法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞IL-1β mRNA表達(dá)水平

1.4.1 引物合成:由賽百盛生物技術(shù)公司合成，序列見(jiàn)表1。

表1 合成引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物分子量

1.4.2 RT-PCR反應(yīng):以TRIzol一步法提取各組老年大鼠心肌細(xì)胞的總RNA。嚴(yán)格按RT-PCR試劑盒的程序操作:①將各樣本的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件為:42℃、30 min→99℃、5 min→5℃、5 min;②分別用相應(yīng)的引物擴(kuò)增IL-1β及GAPDH。其中，IL-1β 的PCR 反應(yīng)條件為:95℃、5 min，94℃、45 s→50℃、1 min →72℃、1 min(33個(gè)循環(huán))，72℃、8 min;③PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后，在圖像分析儀下掃描，以IL-1β與GAPDH的光密度之比作為IL-1β mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 Western bolt方法測(cè)定各組IL-1β蛋白含量按照以下步驟進(jìn)行:①樣本細(xì)胞用4℃的PBS洗滌3次;②加入單去污裂解液，冰上裂解30 min;③取裂解液，4℃下12 000 g離心5 min;④吸取上清液，加入loading buffer后煮5 min，置于－80℃冰箱備用;⑤另取少量上清液，用核酸分析儀測(cè)定其蛋白濃度，計(jì)算各樣品的上樣量;⑥各樣本根據(jù)上樣量進(jìn)行上樣，60 V電壓下進(jìn)行垂直電泳和轉(zhuǎn)膜;⑦5%脫脂奶粉封閉1 h，膜入羊抗鼠一抗中，4℃過(guò)夜;⑧洗膜后加入兔抗羊二抗，室溫下孵育2 h;⑨洗膜后加入發(fā)光液，于暗室中進(jìn)行曝光反應(yīng)。用圖像分析軟件進(jìn)行分析，將IL-1β條帶與GAPDH灰度值與面積的乘積之比，作為其IL-1β蛋白的相對(duì)含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用單因素方差分析，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞的培養(yǎng) 老年大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)成功，在顯微鏡下，心肌細(xì)胞多表現(xiàn)為桿狀或者矩形，表面有清晰的橫紋，少量的心肌細(xì)胞呈現(xiàn)為類圓形，見(jiàn)圖1。

圖1 老年大鼠心肌細(xì)胞(×400)

2.2 心肌細(xì)胞IL-1β mRNA及IL-1β蛋白含量的比較 各組IL-1β mRNA表達(dá)水平、IL-1β蛋白含量見(jiàn)圖2、3及表2。與空白對(duì)照組相比，溶劑對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞的IL-1β mRNA表達(dá)水平及IL-1β蛋白含量均無(wú)顯著差異(P＞0.05);阿托伐他汀組IL-1β mRNA表達(dá)水平及IL-1β蛋白含量均低于空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組(P＜0.01);阿托伐他汀 +GW9662組的IL-1β mRNA表達(dá)水平及IL-1β蛋白含量均高于阿托伐他汀組(P＜0.05)，但仍顯著低于空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組(P＜0.05或P＜0.01)。

圖2 老年大鼠心肌細(xì)胞IL-1β mRNA RT-PCR結(jié)果

圖3 老年大鼠心肌細(xì)胞IL-1β蛋白含量電泳結(jié)果

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞IL-1β mRNA及IL-1β蛋白含量的比較(±s)

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞IL-1β mRNA及IL-1β蛋白含量的比較(±s)

注:IL-1β mRNA表達(dá)水平為IL-1β與GAPDH光密度之比，IL-1β蛋白含量為IL-1β與GAPDH灰度值之比。與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01;與溶劑對(duì)照組比較，cP ＜0.05，dP ＜0.01;與阿托伐他汀組比較，eP＜0.05

組別 鼠數(shù)IL-1β mRNA表達(dá)水平IL-1β蛋白含量阿托伐他汀組 10 0.439 ±0.096bd0.233 ±0.062bd 10 0.726 ±0.132 0.604 ±0.123阿托伐他汀+GW9662組 10 0.568 ±0.104ace0.348 ±0.114bde空白對(duì)照組 10 0.698 ±0.119 0.570 ±0.121溶劑對(duì)照組

3 討論

近年來(lái)，心肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)正日漸成為研究心臟結(jié)構(gòu)、功能與心血管疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的重要手段［5-7］。受技術(shù)水平的限制，國(guó)內(nèi)多數(shù)情況下是用乳鼠的心肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，鮮見(jiàn)以衰老心肌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)來(lái)開(kāi)展研究的報(bào)道。然而，乳鼠的心肌細(xì)胞在代謝和功能方面畢竟不同于衰老心肌細(xì)胞，為準(zhǔn)確反應(yīng)衰老心肌的特點(diǎn)及對(duì)干預(yù)因素的反應(yīng)，特進(jìn)行了研究。

本研究中，阿托伐他汀組心肌細(xì)胞的IL-1β表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組，提示阿托伐他汀有著顯著的抗炎作用，這同以往的研究是一致的。本研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀在自然衰老的生理?xiàng)l件下，也具有抗炎等保護(hù)作用。既往研究表明，炎癥因素在心臟衰老的病理生理過(guò)程中起著重要的作用，心肌細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子后，可直接導(dǎo)致心臟的衰老性改變［8-10］。如炎癥因子可與活性氧協(xié)同促進(jìn)和誘導(dǎo)心血管系統(tǒng)的衰老［11］;炎癥因子在體內(nèi)的含量隨年齡增加而增多，其可通過(guò)多條通路介導(dǎo)機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致心血管系統(tǒng)的老化［12］。因此，在自然衰老狀態(tài)下，阿托伐他汀抑制炎癥因子表達(dá)，提示其可能具有抑制心肌老化改變的作用。

已有的研究證實(shí)，阿托伐他汀干預(yù)可抑制IL-1β 等炎性因子的表達(dá)［13-14］，還可顯著上調(diào) PPARγ的表達(dá)水平［15］。為明確究竟是阿托伐他汀使得PPARγ信號(hào)通路激活，進(jìn)而抑制了IL-1β等炎性因子的表達(dá)，還是阿托伐他汀先抑制了炎性因子IL-1β的表達(dá)，進(jìn)而激活了PPARγ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，本研究采用PPARγ拮抗劑GW9662來(lái)阻斷PPARγ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，然后觀察阿托伐他汀抑制IL-1β表達(dá)的作用有無(wú)受到影響。結(jié)果顯示，給予GW9662阻斷PPARγ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑后，衰老心肌中IL-1β的表達(dá)顯著增強(qiáng)。這一結(jié)果提示，通過(guò)阻斷PPARγ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可部分抑制阿托伐他汀的抗炎作用。這也進(jìn)一步提示阿托伐他汀使得PPARγ信號(hào)通路激活，進(jìn)而抑制了IL-1β等炎性因子的表達(dá)。但在現(xiàn)階段，阿托伐他汀是如何通過(guò)PPARγ信號(hào)通路來(lái)進(jìn)抑制炎性因子IL-1β表達(dá)機(jī)制尚不清楚。

我們?cè)谘芯恐羞€發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀+GW9662組的IL-1β的表達(dá)水平雖高于阿托伐他汀組，但仍明顯低于空白對(duì)照組。這一結(jié)果提示，雖然通過(guò)GW9662阻斷了PPARγ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，阿托伐他汀抑制IL-1β表達(dá)的作用仍未被完全阻斷。這也進(jìn)一步提示，激活PPARγ信號(hào)通路僅是阿托伐他汀抗炎作用的重要途徑之一，但并不是唯一的途徑。究竟在PPARγ信號(hào)通路以外，還存在哪些信號(hào)通路來(lái)介導(dǎo)阿托伐他汀抑制衰老心肌細(xì)胞中炎性因子表達(dá)的作用，目前尚不十分清楚，需要進(jìn)一步加以研究。

［1］Jaiswal S R，Sontakke S D.Experimental evaluation of analgesic and anti-inflammatory activity of simvastatin and atorvastatin［J］.Indian J Pharmacol，2012，44(4):475-479.

［2］Kotlega D，Ciecwiez S，Turowska K J，et al.Pathogenetic justification of statin use in ischaemic stroke prevention ac-cording to inflammatory theory in development of atherosclerosis［J］.Neurol Neurochir Pol，2012，46(2):176-183.

［3］Yao J，Xiong M，Tang B，et al.Simvastatin attenuates pulmonary vascular remodelling by down-regulating matrix metalloproteinase-1 and 9 expression in a carotid artery-jugular vein shunt pulmonary hypertension model in rats［J］.Eur J Cardiothorac Surg，2012，42(5):121-127.

［4］Rohilla A，Khan M U，Khanam R.Cardioprotective potential of simvastatin in the hyperhomocysteinemic rat heart［J］.J Adv Pharm Technol Res，2012，3(3):193-198.

［5］Yu J Z，Bondy G P，Allard M F，et al.Serum from patients with chronic renal insufficiency alters growth characteristics and ANP mRNA expression of adult rat cardiac myocytes［J］.J Mol Cell Cardiol，1996，28(12):2429-2441.

［6］Schluter K D，Goldberg Y，Taimor G，et al.Role of phosphatidylinositol 3-kinase activation in the hypertrophic growth of adult ventricular cardiomyocytes［J］.Cardiovasc Res，1998，40(1):174-181.

［7］Clark W A，Decker M L，Behnke B M，et al.Cell contact as an independent factor modulating cardiac myocytes hypertrophy and survival in longterm primary culture［J］.J Mol Cell Cardiol，1998，30(1):139-155.

［8］Chung H Y，Sung B，Jung K J，et al.The molecular inflammatory process in aging［J］.Antioxid redox signal，2006，8(3-4):572-581.

［9］de Gonzalo C D，Neitzert K，F(xiàn)ernández M，et al.Differential inflammatory responses in aging and disease:TNF-alpha and IL-6 as possible biomarkers［J］.Free Radic Biol Med，2010，49(5):733-737.

［10］Krieglstein K，Miyazono K，Dijke P，et al.TGF-β in aging and disease［J］.Cell Tissue Res，2012，347(1):5-9.

［11］Sung B，Park S，Yu B P，et al.Amelioration of age related inflammation and oxidative stress by PPARγ activator:Suppression of NF-κB by 2，4-thiazolinedione［J］.Exp Gerontol，2006，41(6):590-599.

［12］Domenighetti A A，Wang Q，Egger M，et al.AngiotensinⅡ-mediated phenotypic cardiomyocyte remodeling leads to age-dependent cardiac dysfunction and failure［J］.Hypertrophy，2005，46(2):426-432.

［13］Sun T W，Zhang J Y，Li L，et al.Effect atorvastatin on serum tumor necrosis factor alpha and interleukin-1β following acute pulmonary embolism［J］.Exp Lung Res，2011，37(2):78-81.

［14］Sun Y M，Tian Y，Li X，et al.Effect of atorvastatin on expression of IL-10 and TNF-alpha mRNA in myocardial ischemia-reperfusion injury in rats［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，382(2):336-340.

［15］Yang P，Li Y，Li J J，et al.Up-regulating PPAR-γ expression and NO concentration，and down-regulating PAI-1 concentration in a rabbit atherosclerotic model:the possible antiatherogenic and antithrombotic effects of atorvastatin［J］.Int J Cardiol，2005，139(3):213-217.