羅國彪 舒建昌

暨南大學醫(yī)學院附屬廣州市紅十字會醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東廣州 510220

肝纖維化是由于各種致病因子引起肝臟的損傷和炎癥，導(dǎo)致纖維組織廣泛增生和沉積，其發(fā)生、發(fā)展過程與細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的沉積與降解相對失衡有關(guān)，而ECM的變化和組織基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）表達有密切的關(guān)系，本研究通過動物實驗方法，結(jié)合既往實驗基礎(chǔ)上[1]，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法、免疫組化染色法分別檢測正常及肝纖維化大鼠血清及肝組織MMP-1及TIMP-1表達的變化，分析兩者在肝纖維化中的作用，以期為肝纖維化預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選擇 2011年11月～2013年 11月，SPF級SD大鼠20只，體質(zhì)量180～200 g，雄性，購自南方醫(yī)科大學動物實驗中心[SCXK（粵）200620015粵監(jiān)證字2006B2008]。于廣東省藥物研究所標準SPF級動物實驗室 （合格證號：2006C125號）進行動物飼養(yǎng)及實驗。

1.1.2 試劑 大鼠MMP-1及大鼠TIMP-1定量檢測試劑盒（ELISA）（上海西唐生物科技有限公司），大鼠抗MMP-1及大鼠TIMP-1單克隆抗體 （武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 肝纖維化模型建立：根據(jù)前期實驗[2]及相關(guān)文獻建模[1-3]。

1.2.2 實驗分組及處理 20只雄性SD大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，隨機分為2組，正常組10只大鼠，不作其他處理，常規(guī)飼養(yǎng)12周；模型組10只大鼠，腹腔注射CCl40.025 mL（用花生油1∶6稀釋），每周3次，動物實驗共12周。動物實驗結(jié)束后，采用摘眼球采血法最大量取血，并置于未加抗凝劑的普通干凈玻璃試管中。剖開大鼠腹腔暴露肝臟，留取肝臟左葉，留取部分肝組織于4%中性福爾馬林液固定，置于包埋盒中，于切片機切片，厚度3 μm，裱片于普通載玻片上進行免疫組化染色。

1.2.3 指標檢測 按照試劑盒說明書以ELISA方法檢測血清MMP-1和TIMP-1含量；免疫組化染色檢測肝組織MMP-1和TIMP-1表達，組織中出現(xiàn)棕色或黃色的部位為陽性表達部位，在高倍鏡（400×）下，每張切片隨機選擇10個視野，采用專業(yè)顯微彩色圖像分析軟件計算每個視野下陽性部位面積的百分比，取其均值為該張切片的陽性表達面積，再進行統(tǒng)計學處理。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 12.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩獨立樣本的計量資料采用t檢驗；計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血清MMP-1及TIMP-1含量比較

模型組大鼠血清中MMP-1含量較正常組明顯降低，差異有高度統(tǒng)計學意義 （t=13.38，P<0.01），血清中TIMP-1含量升高明顯，差異有高度統(tǒng)計學意義（t=31.92，P<0.01）。見表1。

表1 血清MMP-1及TIMP-1含量比較（±s）

表1 血清MMP-1及TIMP-1含量比較（±s）

注：與正常組比較，▲P<0.01；MMP-1：基質(zhì)金屬蛋白酶-1；TIMP-1：基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1

553.81±98.89 113.49±18.95▲13.38<0.01 10.17±1.35 25.84±0.76▲31.92<0.01 MMP-1（μg/L） TIMP-1（μg/L）正常組模型組t 值P 10 10組別 只數(shù)

2.2 肝組織MMP-1及TIMP-1陽性百分比分析

MMP-1 模型組陽性表達面積比例[（5.60±1.51）%]與正常組比較明顯下降，差異有高度統(tǒng)計學意義（t=14.37，P<0.01）。TIMP-1陽性百分比分析，模型組陽性表達面積與正常組比較明顯升高，差異有高度統(tǒng)計學意義（t=38.96，P<0.01）。見表2。

3 討論

肝纖維化的發(fā)生是一過復(fù)雜的過程，往往會帶來肝硬化甚至肝癌等不良的后果，積極探索肝纖維化發(fā)病機制，尋求有效治療措施對降低肝硬化發(fā)病率具有重要意義。肝纖維化發(fā)生的原因較多，一般是ECM的生成與沉積增加，造成ECM積累，最后導(dǎo)致肝纖維化。肝纖維化的形成過程主要取決于膠原的合成、沉積、降解、吸收的動態(tài)平衡，其消退的特征是肝纖維化基質(zhì)的降解和正常肝組織的恢復(fù)，其發(fā)生、發(fā)展過程與ECM，特別是膠原的沉積與降解相對失衡有關(guān)，這種過度沉積不僅是由于ECM合成增多，更大程度上是由于降解減少引起[4-5]，提示促進ECM各成分的降解是抗肝纖維化的重要途徑，影響ECM降解的主要是MMPS和TIMPS，而ECM主要是Ⅰ、Ⅲ型膠原的沉積。目前在肝內(nèi)共發(fā)現(xiàn)了8種基質(zhì)金屬蛋白酶，其中MMP-1能夠降解纖維化中肝臟中ECM的主要成分Ⅰ、Ⅲ型膠原[6]，TIMP-1增加和（或）MMP-1減少，可使ECM降解減少，特別是膠原降解減慢，導(dǎo)致組織纖維化發(fā)生，反之，導(dǎo)致ECM發(fā)生破壞性重建[7]。TIMP-1是體內(nèi)MMP-1的特異性抑制劑，它能通過其N-末端特異性地與MMP-1催化活性中心的鋅離子結(jié)合，從而封閉其催化活性，使有活性的MMP-1失活[8]，TIMP-1是抑制MMP活性的一組多功能因子家族的主要成員之一，是一種分子質(zhì)量單位約為28.5 kd的糖蛋白，在肝臟中由枯否細胞、肝星狀細胞及肌纖維母細胞產(chǎn)生。活化的肝星狀細胞表達TIMP-1最強，TIMP-1主要抑制MMP-1活性[9]，TIMP-1主要由激活的肝星狀細胞、肝細胞、內(nèi)皮細胞分泌，主要作用是抑制膠原酶的活性，同時抑制基質(zhì)分解素和明膠B，在肝纖維化時其表達明顯增加，主要由位于肝中央靜脈、匯管區(qū)周圍及肝竇壁的間質(zhì)細胞分泌[10]，因而TIMP-1在肝組織中的表達水平可以反映肝組織學纖維化程度[11-12]。前期研究顯示，經(jīng)復(fù)方中藥干預(yù)的大鼠肝組織中的Ⅰ、Ⅲ型膠原含量明顯降低，造模組MMP-1表達降低、TIMP-1表達升高，復(fù)方中藥組MMP-1表達明顯升高，與造模組相比，正常組及復(fù)方中藥組MMP-1表達顯著升高，TIMP-1表達明顯降低[13-16]，與本實驗結(jié)果相一致。本研究結(jié)果顯示，血清及肝組織MMP-1及TIMP-1與肝纖維化關(guān)系密切，史玉嶺[17]使用ROC曲線評估TIMP-1診斷肝纖維化的敏感度、特異性，明顯高于肝纖維化標記物HA、PCⅢ、CⅣ、LN，提示血清 TIMP-1診斷肝纖維化有較高的敏感度和特異性，其水平可反映肝纖維化的程度。

表2 各組大鼠肝組織MMP-1及TIMP-1免疫組化圖像分析面積百分比（%，±s）

表2 各組大鼠肝組織MMP-1及TIMP-1免疫組化圖像分析面積百分比（%，±s）

注：與正常組比較，▲P<0.01；MMP-1：基質(zhì)金屬蛋白酶-1；TIMP-1：基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1

19.20±1.48 5.60±1.51▲14.37<0.01 3.22±0.70 17.10±0.84▲38.96<0.01 MMP-1 TIMP-1正常組模型組t 值P 10 10組別 只數(shù)

本研究為肝纖維化判斷指標提供實驗佐證并為臨床上尋找治療肝纖維化藥物打下了實驗基礎(chǔ)，而如何調(diào)節(jié)MMP-1及TIMP-1兩者的平衡，抑制TIMP-1的表達將為防治肝纖維化提供新的研究方向。

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