劉曉曉 賈鳳蘭 阮 明 張寶旭

北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)系 國家中醫(yī)藥管理局中藥配伍減毒重點(diǎn)研究室，北京 100191

1，3-二苯-1，3-丙二酮 （1，3-diphenyl-1，3-proanedione，DPPD），是存在于甘草根中的一種 β-二酮類物質(zhì)[1]，研究發(fā)現(xiàn)其具有化學(xué)防癌[2-4]、抑制DNA及蛋白質(zhì)損傷、抗氧化[5]、抗炎癥等多方面的功效。本實(shí)驗(yàn)室對其多年的研究發(fā)現(xiàn)，DPPD能夠拮抗四氯化碳、可卡因、N-甲基甲酰胺等化學(xué)物質(zhì)造成的肝臟損傷[5-7]。在以往研究的基礎(chǔ)上，本研究對其遺傳毒性進(jìn)行評價(jià)，并探討DPPD對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞微核形成有無預(yù)防保護(hù)作用，提供DPPD臨床應(yīng)用的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

ICR雄性小鼠，體重16～18 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2011-0012，使用許可證號：SYXK（京）2011-0039。在恒溫（21～23℃）、恒濕（45%～65%）、12 h明暗周期交替的動物飼養(yǎng)室，實(shí)驗(yàn)前小鼠先適應(yīng)3 d，自由進(jìn)食和飲水。

1.2 試劑

DPPD（批號：S26175 005），購自 MERCK-Schuchardt，用1%（V/V）吐溫-80水溶液配置成混懸液；環(huán)磷酰胺（批號：09121721），江蘇恒瑞醫(yī)院股份有限公司，用生理鹽水溶解；甲醇（分析純，批號：20100607），北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司；小牛血清，上海拜力生物科技有限公司。

1.3 儀器

AR2130/C型電子天平（210 g/0.001 g，美國OHAUS公司）；OLYMPUS 顯微鏡。

1.4 方法

40只小鼠隨機(jī)分為8組，分別為陰性對照組，環(huán)磷酰胺陽性對照組，環(huán)磷酰胺+DPPD低、中、高劑量組（62.5、250、1000 mg/kg），DPPD 低、中、高劑量組（62.5、250、1000 mg/kg），每組各5只。環(huán)磷酰胺+DPPD劑量組和DPPD劑量組經(jīng)口給予DPPD 30 d，每天1次，給藥體積0.2 mL/10g。陰性對照組每天給予相同體積的1%（V/V）吐溫-80水溶液。環(huán)磷酰胺采用30 h兩次經(jīng)口給藥法，給藥劑量40 mg/kg，給藥體積0.1 mL/10g，小鼠給藥第29天，環(huán)磷酰胺陽性組和環(huán)磷酰胺+DPPD劑量組經(jīng)口給予環(huán)磷酰胺，間隔24 h后，第2次經(jīng)口給予環(huán)磷酰胺，第2次給藥6 h后，小鼠麻醉后頸椎脫臼處死。立即取股骨制備骨髓涂片，涂片自然干燥后用甲醇固定，經(jīng)Giemsa染色，蒸餾水沖洗、晾干。采用雙盲法閱片，每只小鼠計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，觀察含有微核數(shù)的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，以千分率表示微核數(shù)，并計(jì)算抑制率，抑制率計(jì)算方法：抑制率（%）=（致突變物對照組微核率-受試樣品組微核率）/（致突變物對照組微核率-空白對照組微核率）×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，比較t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DPPD對骨髓微核形成的影響

與陰性對照組相比，DPPD組小鼠經(jīng)口給予DPPD 30 d，DPPD各劑量組微核率變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），由此可以看出DPPD本身不具有遺傳毒性，見表1。

表1 DPPD對骨髓細(xì)胞微核形成的影響

2.2 環(huán)磷酰胺對骨髓細(xì)胞微核形成的影響

與陰性對照組相比，環(huán)磷酰胺30 h經(jīng)口給藥后，環(huán)磷酰胺陽性組小鼠微核率明顯升高，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明環(huán)磷酰胺造模成功。見表2。

表2 環(huán)磷酰胺對骨髓細(xì)胞微核形成的影響

2.3 DPPD對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞微核的影響

結(jié)果所示，與環(huán)磷酰胺陽性組相比，環(huán)磷酰胺+DPPD低劑組小鼠微核率變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；環(huán)磷酰胺+DPPD中、高劑量組小鼠微核率明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；其微核抑制率分別為35.58%和61.54%。隨著DPPD劑量的升高，微核率逐漸下降，并呈現(xiàn)一定的劑量反應(yīng)關(guān)系。見表3。

表3 DPPD對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞微核形成的影響

3 討論

目前，微核試驗(yàn)是一種應(yīng)用廣泛的遺傳毒性檢測方法之一，是反映染色體損傷的一種簡易、快速的方法。很多國家和國際組織將微核實(shí)驗(yàn)規(guī)定為評價(jià)新藥和食品添加劑等化合物安全性毒理學(xué)評價(jià)的必做試驗(yàn)之一[8]。它主要是通過微核率的變化情況反映化學(xué)物質(zhì)的遺傳毒性，因此微核率是檢測細(xì)胞遺傳毒性損傷的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

有文獻(xiàn)報(bào)道，長期喂養(yǎng)DPPD（1%飼料含量）未觀察到實(shí)驗(yàn)動物的毒性體征[9]。本實(shí)驗(yàn)室通過DPPD急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)DPPD小鼠經(jīng)口灌胃的LD50＞17.5 g/kg，可以認(rèn)為是低毒或無毒物質(zhì)。

本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，通過比較DPPD組和陰性組發(fā)現(xiàn)長期灌胃給予DPPD并未使骨髓細(xì)胞微核形成率升高；通過比較環(huán)磷酰胺+DPPD組與環(huán)磷酰胺陽性組發(fā)現(xiàn)DPPD對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞微核形成具有一定的預(yù)防保護(hù)作用，能夠明顯抑制環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的骨髓細(xì)胞微核形成，且隨著DPPD劑量的增加，抑制作用增強(qiáng)，此結(jié)果提示DPPD不具有遺傳毒性，并且可以拮抗環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞微核的形成。環(huán)磷酰胺常用于抗腫瘤[10]治療，同時(shí)環(huán)磷酰胺具有免疫抑制作用，并用于自身免疫性疾病的治療[11-14]，其療效顯著，應(yīng)用廣泛。但是環(huán)磷酰胺常常引起骨髓抑制不良反應(yīng)，使其應(yīng)用受限。而DPPD本身可以應(yīng)用于化學(xué)防癌[2-4]，如果將DPPD與環(huán)磷酰胺聯(lián)合使用，不但可以拮抗環(huán)磷酰胺的毒副作用，而且可以提高其抗癌療效。因此，本研究將在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究DPPD作用機(jī)制，并研究與其他藥物聯(lián)合使用的效果，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

[1]Weng CJ，Yang YT，Ho CT，et al.Mechanisms of apoptotic effects induced by resveratrol，dibenzoylmethane，and their analogues on human lung carcinoma cells[J].J Agric Food Chem，2009，57（12）：5235-5243.

[2]Mou-Tuan Huang，Yue Liu，Jian-Guo Xie，et al.Protective Effect of Dibenzoylmethane on Chemicall-and UV Light-Induced Skin，Inflammation， Sunburn Lesions，and Skin Carcinogenesis in Mice[J].Food Factors in Health Promotion and Disease Prevention，2003， （9）：196-207.

[3]Thimmulappa RK，Rangasamy T，Alam J，et al.Dibenzoylmethane activates Nrf2-dependent detoxification pathway and inhibits benzo（a）pyrene induced DNA adducts in lungs[J].Med Chem，2008，4（5）：473-481.

[4]MacDonald CJ，Ciolino HP，Yeh GC.Dibenzoylmethane modulates aryl hydrocarbon receptor function and expression of cytochromes P450 1A1， 1A2， and 1B1[J].Cancer Res，2001，61（10）：3919-3924.

[5]賈鳳蘭，趙琦，張祝琴，等.1，3-二苯-1，3-丙二酮對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J].中國新藥雜志，2006，15（1）：26-29.

[6]呂艷，丁兆豐，馬秋霞，等.1，3-二苯-1，3-丙二酮對可卡因致小鼠肝毒性及神經(jīng)毒性的保護(hù)作用[J].中國藥物依賴性雜志，2011，20（2）：87-92.

[7]薛茹，王璐，賈鳳蘭，等.1，3-二苯-1，3-丙二酮對N-甲基甲酰胺致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J].中國新藥雜志，2012，21（22）：2627-2630.

[8]余明澤，劉以農(nóng)，蔣中仁，等.環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞微核的影響因素的研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，34（5）：935-936.

[9]Khor TO，Yu S，Barve A，et al.Dietary feeding of dibenzoylmethane inhibits prostate cancer in transgenic adenocarcinoma of the mouse prostate model[J].Cancer Res，2009，69（17）：7096-7102.

[10]遲淑萍，白冰珂，謝進(jìn)，等.環(huán)磷酰胺在動物模型體內(nèi)抗腫瘤影響及抑瘤機(jī)制的研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，9（14）：20-22.

[11]楊憲勇.應(yīng)用環(huán)磷酰胺構(gòu)建C57BL/6J小鼠免疫抑制模型[J].中國組織工程研究，2012，16（40）：7486-7490.

[12]齊麗娟，宋雁，王偉，等.用環(huán)磷酰胺建立小鼠免疫抑制動物模型[J].衛(wèi)生研究，2010，39（3）：313-315.

[13]李相玲，白莎莎，周聯(lián)，等.環(huán)磷酰胺和地塞米松對小鼠腸道黏膜免疫抑制的比較[J].中國免疫學(xué)雜志，2013，29（1）：39-47.

[14]蔡曉懿，夏正坤，張瑩，等.霉酚酸酯與環(huán)磷酰胺治療重型狼瘡腎炎的 Meta 分析[J].中華臨床醫(yī)師雜志，2012，6（24）：8160-8166.