劉 偉 繆建春

廣東省深圳市龍崗中心醫(yī)院藥劑科，廣東深圳 518116

小膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)的主要免疫細胞，存在靜息和激活兩種狀態(tài)，在腦缺血損傷、炎癥反應、神經退行性疾病發(fā)生時易被激活并分泌多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1，IL-1β）和活性氧（reactive oxygen species，ROS），一氧化氮（nitric oxide，NO）等細胞毒性物質[1-2]。因此，抑制小膠質細胞激活的藥物對治療神經系統(tǒng)病變具有重要意義。人參皂苷 CK[20-O-β-D-葡萄糖基-20（S）-原人參二醇，compound K，CK]是原人參二醇型人參皂苷Rb1、Rb2和Rc等在人體內主要吸收形式和藥效實體，具有廣泛的藥理作用，如抗腫瘤、抗糖尿病、抗過敏等，并可通過多種途徑發(fā)揮抗炎作用[3-5]。同時，原人參二醇型人參皂苷的神經保護作用也得到了充分認識[6-7]。本課題旨在觀察人參皂苷CK的抗炎及神經保護作用并探討其作用機制，為其成為治療神經系統(tǒng)病變的藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

ICR小鼠120只（雄性，SPF級，18～22 g）；SD大鼠70只（雄性，4～5個月，SPF 級，180～220 g）；新生SD大鼠1只（2 d）由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，所有動物實驗均符合廣東省和深圳市龍崗中心醫(yī)院關于實驗動物福利和倫理學的要求。

1.2 試劑

人參皂苷CK（四川維克奇生物科技有限公司，HPLC≥98%）；過氧化物酶標記的鏈霉卵白素-親和素SP試劑盒（北京中山生物技術公司）；小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（上海易利生化試劑有限公司）；小鼠白細胞介素1β（IL-1β）ELISA試劑盒（上海滬峰化工有限公司）；細胞內活性氧（ROS）紅色熒光測定試劑盒（上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司）。脂多糖（LPS）、地塞米松、生物素標記的B4凝集素購自Sigma公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司，其他試劑均為國產分析純。

1.3 方法

1.3.1 人參皂苷CK對LPS誘導小鼠敗血癥的影響

1.3.1.1 分組、給藥及造模 ICR小鼠120只，隨機分為6組，即正常對照組、模型對照組、陽性對照組（地塞米松30 mg/kg）、人參皂苷 CK 低、中、高劑量組（10、20、40 mg/kg），每組 20 只。正常對照組和模型對照組給予生理鹽水，陽性對照組給予地塞米松30 mg/kg，人參皂苷CK低、中、高劑量組分別給予人參皂苷 CK 10、20、40 mg/kg，腹腔注射，0.1 mL/10 g，連續(xù)給藥7 d，末次給藥后30 min，除正常對照組外，其余各組均腹腔注射 LPS 5 mg/kg（0.1 mL/10 g）。

1.3.1.2 指標測定 ①膠質細胞凝集素標記染色：注射LPS 3 h后，每組隨機選取10只小鼠麻醉處死，取腦，快速脫水，低溫石蠟包埋，冠狀組織切片（厚度約30 μm，間隔600 μm），37℃恒溫箱中脫蠟至水，加入含3%H2O2的甲醇室溫孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min，加入生物素標記的B4凝集素（終濃度 5 μg/mL）37℃孵育 1 h，然后置于 4℃冰箱孵育24 h（陰性對照用0.01 mol/L PBS替代凝集素），PBS沖洗2次，每次5 min，加入過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液37℃孵育30 min，PBS沖洗2次，每次5 min，自來水洗，蘇木紅復染1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。②TNF-α、IL-1β含量測定：注射LPS 6 h后將每組剩余的10只小鼠麻醉處死，取腦，組織勻漿，取上清液按試劑盒說明操作用ELISA法測定TNF-α、IL-1β的含量。

1.3.2 人參皂苷CK對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響

1.3.2.1 分組、給藥及造模 SD大鼠70只，隨機分為5組，即假手術組、模型組、人參皂苷CK低、中、高劑量組（10、20、40 mg/kg），每組14只。假手術組和模型組給予生理鹽水，人參皂苷CK低、中、高劑量組分別給予人參皂苷CK 10、20、40 mg/kg，腹腔注射，0.2 mL/100 g，連續(xù)給藥 7 d，末次給藥后30 min，參照Longa等[8]的方法，采用頸內動脈線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞 （middle cerebral artery occlu sion，MCAO）模型。簡述如下：大鼠麻醉后固定，分離并結扎頸總動脈近心端及頸外動脈根部，夾閉頸總動脈遠心端，距分叉約10 mm處剪口插入頭端膨大的尼龍魚線約18 mm。假手術組僅分離頸總及頸外動脈，不插線。選擇蘇醒后行走向右旋轉或右側肢體癱瘓的大鼠為栓堵成功者進行實驗。缺血3 h后行再灌注。

1.3.2.2 指標測定 各組動物在缺血再灌注72 h后處死，取腦，快速脫水，低溫石蠟包埋，冠狀組織切片（厚度約30 μm，間隔600 μm），分別做紅四氮唑（TTC）染色和小膠質細胞凝集素標記染色。TTC染色：將切片置于TTC溶液中37℃孵育30 min，正常腦組織被染為紅色，梗死灶呈白色，用病理圖像分析系統(tǒng)（BN-TW-5001）分析，計算梗死灶體積值和缺血側半球體積值并計算梗死體積百分比[9]。小膠質細胞凝集素標記染色方法同“1.3.1.2”項下。

1.3.3 人參皂苷CK對LPS激活原代培養(yǎng)小膠質細胞的影響

1.3.3.1 細胞培養(yǎng) 小膠質細胞原代培養(yǎng)參照Park等[10]方法進行，簡述如下：新生SD大鼠1只（2 d）麻醉后處死，取腦，分離大腦皮層并消化，細胞懸液過濾后加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基 （含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）終止消化，反復吹打制成單細胞懸液，離心棄上清，DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸后靜置30 min，取細胞懸液接種到多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 h后換液，以后每2天換液1次，顯微鏡下觀察到出現(xiàn)細胞分層現(xiàn)象后，吸棄培養(yǎng)液，加入無血清DMEM/F12培養(yǎng)液3∶1稀釋的胰蛋白酶（25%）消化25～40 min，將含有懸浮的小膠質細胞的培養(yǎng)液轉入另一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h后更換DMEM/F12完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，經鑒定小膠質細胞純度>95%后開始實驗。

1.3.3.2 指標測定 ①細胞形態(tài)觀察：細胞接種于24孔培養(yǎng)板中 （5×104個/孔），分為正常對照組、LPS組和人參皂苷CK 低、中、高劑量組（20、40、80 mmol/L）。細胞培養(yǎng) 16 h后加入人參皂苷CK（以DMEM/F12完全培養(yǎng)基配制，正常對照組和LPS組加入等體積培養(yǎng)基）培養(yǎng)24 h，再加入LPS（1 mg/L）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，40 g/L多聚甲醛固定 10 min，凝集素標記染色（方法同“1.3.1.2”項下），倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。②培養(yǎng)液中一氧化氮（NO）含量測定：細胞接種于 24孔培養(yǎng)板（3×106個/孔），培養(yǎng)16 h后，分組與藥物處理方法同上。處理到預定時間后，吸取培養(yǎng)上清液100 μL加入96孔板，加入等體積Griess試劑（5%磷酸配制1%磺胺，蒸餾水配制0.1%鹽酸萘乙二胺，臨用前等體積混合）混勻，室溫避光靜置10 min，酶標儀測540 nm吸光度值，亞硝酸鈉繪制標準曲線，計算樣品中NO的量，平行測定3次，計算平均值。③細胞內ROS含量測定：細胞接種于6孔培養(yǎng)板（6×106個/孔），分組與藥物處理方法同上，處理到預定時間后，嚴格按照ROS試劑盒說明書操作，采用流式細胞儀測定ROS相對含量 （設正常對照組細胞內ROS含量為1），平行測定3次，計算平均值。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 人參皂苷CK對LPS誘導小鼠敗血癥的影響

凝集素標記染色顯示，模型對照組凝集素標記陽性細胞數(shù)[（58±14）個/500 μm2]明顯多于正常對照組[（10±3）個/500 μm2]，差異有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），陽性細胞形態(tài)大小不一，多為圓形和橢圓形，少數(shù)有樹枝狀分枝，證明LPS可誘導小鼠腦內小膠質細胞激活。陽性對照組（地塞米松）[（31±9）個/500 μm2]和人參皂苷 CK 低[（38±8）個/500 μm2]、中[（22±5）個/500 μm2]、高[（16±4）個/500 μm2]劑量組凝集素陽性細胞數(shù)均少于模型對照組[（58±14）個/500 μm2]，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），證明人參皂苷CK可減少LPS誘導的敗血癥小鼠腦內小膠質細胞的激活。見表1。模型對照組腦內 TNF-α [（198.38±12.84）mg/L]和 IL-1β [（845.15±41.97）ng/L]含量明顯高于正常對照組[（106.71±11.21）mg/L、（477.46±49.76）ng/L]、陽性對照組[（141.46±11.91）mg/L、（690.94±54.71）ng/L]和人參皂苷 CK低[（157.23±12.25）mg/L、（726.04±64.29）ng/L]、中[（136.58±13.17）mg/L、（651.88±55.65）ng/L]、高[（121.33±12.09）mg/L、（577.36±51.86）ng/L]劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），證明人參皂苷CK可減少LPS誘導的TNF-α和IL-1β表達。見表2。

表1 人參皂苷CK對LPS誘導小鼠敗血癥凝集素陽性細胞數(shù)的影響（個/500 μm2，±s）

表1 人參皂苷CK對LPS誘導小鼠敗血癥凝集素陽性細胞數(shù)的影響（個/500 μm2，±s）

注：與正常對照組比較，#P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；LPS：脂多糖

正常對照組模型對照組陽性對照組人參皂苷CK低劑量組人參皂苷CK中劑量組人參皂苷CK高劑量組10±3 58±14#31±9*38±8*22±5**16±4**組別 凝集素陽性細胞數(shù)

2.2 人參皂苷CK對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的影響

TTC染色顯示，模型組腦片中有明顯的不顯色區(qū)域（白色），與周圍正常腦組織界限清楚，假手術組腦組織紅染，未見明顯梗死灶。凝集素標記染色顯示，模型組梗死灶邊緣分布有大量凝集素標記陽性的細胞，模型組凝集素陽性細胞數(shù)[（46±11）個/500 μm2]明顯高于假手術組[（11±3）個/500 μm2]，差異有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）；人參皂苷CK 低[（30±7）個/500 μm2]、中[（20±5）個/500 μm2]、高[（13±4）個/500 μm2]劑量組凝集素陽性細胞數(shù)均低于模型組[（46±11）個/500 μm2]，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05 或 P<0.01）；與模型組比較，人參皂苷CK低、中、高劑量組能明顯減少腦梗死灶體積的百分比，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），并能抑制小膠質細胞的激活。見圖1、表3。

表2 人參皂苷CK對LPS誘導小鼠敗血癥腫瘤壞死因子-α及白細胞介素-1β含量的影響（±s）

表2 人參皂苷CK對LPS誘導小鼠敗血癥腫瘤壞死因子-α及白細胞介素-1β含量的影響（±s）

注：與正常對照組比較，#P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.05；**P<0.01；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-1β：白細胞介素-1β

正常對照組模型對照組陽性對照組人參皂苷CK低劑量組人參皂苷CK中劑量組人參皂苷CK高劑量組106.71±11.21 198.38±12.84#141.46±11.91*157.23±12.25*136.58±13.17**121.33±12.09**477.46±49.76 845.15±41.97#690.94±54.71*726.04±64.29*651.88±55.65*577.36±51.86**組別 TNF-α（mg/L） IL-1β（ng/L）

圖1 人參皂苷CK對大鼠局灶性腦缺血梗死體積百分比的影響

表3 人參皂苷CK對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷中凝集素陽性細胞數(shù)的影響（個/500 μm2，±s）

表3 人參皂苷CK對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷中凝集素陽性細胞數(shù)的影響（個/500 μm2，±s）

注：與假手術組比較，#P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

假手術組模型組人參皂苷CK低劑量組人參皂苷CK中劑量組人參皂苷CK高劑量組11±3 46±11#30±7*20±5**13±4**組別 凝集素陽性細胞數(shù)

2.3 人參皂苷CK對LPS激活原代培養(yǎng)小膠質細胞的影響

凝集素標記染色顯示LPS（1 mg/L）處理細胞24 h，原代培養(yǎng)的小膠質細胞形態(tài)發(fā)生變化，與正常對照組相比，細胞即呈激活狀態(tài)：細胞形態(tài)變大，伸出突起，呈多角形，熒光亮度強；對照組細胞呈圓形，熒光強度弱。不同濃度人參皂苷 CK （20、40、80 mmol/L）預保護 24 h，對 LPS 誘導的激活形態(tài)有明顯恢復作用，細胞基本恢復到與正常對照組相同。用LPS（1mg/L）處理24h，LPS組細胞培養(yǎng)液中的NO濃度[（23.19±0.45）mol/L]明顯高于正常對照組[（0.67±0.22）mol/L]，差異有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）；不同濃度人參皂苷CK（20、40、80 mmol/L）預處理 24 h，人參皂苷 CK 低[（18.16±0.59）mol/L]、中[（12.43±0.52）mol/L]、高[（6.17±0.34）mol/L]劑量組細胞培養(yǎng)液中的NO濃度均低于LPS組[（23.19±0.45）mol/L]，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或 P<0.01），說明人參皂苷CK對LPS導致的胞外NO濃度有抑制作用。不同人參皂苷 CK（20、40、80 mmol/L）預處理 24 h，人參皂苷CK 低[（1.78±0.14）mol/L]、中[（1.56±0.23）mol/L]、高[（1.13±0.09）mol/L]劑量組細胞內 ROS 濃度均低于 LPS組[（2.57±0.13）mol/L]，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05 或 P<0.01），對LPS導致的ROS表達陽性的細胞數(shù)的增加有顯著抑制作用。結果表明人參皂苷CK可抑制LPS誘導的小膠質細胞激活并可抑制LPS誘導的NO含量和ROS含量增加。見圖2、表4。

圖2 人參皂苷CK對LPS誘導原代培養(yǎng)小膠質細胞形態(tài)的影響

表4 人參皂苷CK對LPS誘導原代培養(yǎng)小膠質細胞培養(yǎng)液內NO含量及細胞內ROS含量變化的影響（mol/L，±s）

表4 人參皂苷CK對LPS誘導原代培養(yǎng)小膠質細胞培養(yǎng)液內NO含量及細胞內ROS含量變化的影響（mol/L，±s）

注：與正常對照組比較，#P<0.01；與 LPS 組比較，*P<0.05，**P<0.01；LPS：脂多糖；NO：一氧化氮；ROS：活性氧

正常對照組LPS組LPS+20 mmol/L人參皂苷CK LPS+40 mmol/L人參皂苷CK組LPS+80 mmol/L人參皂苷CK組0.67±0.22 23.19±0.45#18.16±0.59*12.43±0.52**6.17±0.34**1.00±0.10 2.57±0.13#1.78±0.14*1.56±0.23*1.13±0.09**組別 NO含量 ROS含量

3 討論

小膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)中重要的免疫細胞，正常情況下處于靜息狀態(tài)，數(shù)量很少，當發(fā)生腦缺血、中風、炎癥反應或神經退行性疾病時，小膠質細胞從靜息狀態(tài)向激活狀態(tài)轉變。在小膠質細胞發(fā)生激活時，形態(tài)上會發(fā)生改變，原代培養(yǎng)的小膠質細胞，由圓形或具有分枝的形態(tài)變大為阿米巴狀[11]。在動物模型上亦可觀察到類似的改變。小膠質細胞的標志物較多，其中，凝集素B4可標志激活的小膠質細胞，而靜息狀態(tài)的小膠質細胞對其呈陰性。因此，可采用凝集素B4標記陽性來作為小膠質細胞激活的判斷標準之一。

敗血癥乃是一種常見的臨床危重急癥，病死率高達40%～70%，可發(fā)生全身性炎癥反應[12]。LPS是常用于制作實驗性敗血癥模型的物質之一，可誘導小膠質細胞的激活，并釋放出TNF-α、IL-1β等許多細胞因子和炎癥介質，導致細胞、組織、器官的損傷[13]。因此，抑制小膠質細胞的激活和細胞因子及炎癥介質的釋放，對敗血癥患者具有一定的保護作用。本課題采用LPS復制小鼠敗血癥模型，觀察人參皂苷CK對其影響，結果表明，人參皂苷CK可有效抑制LPS誘導的小膠質細胞激活，并可顯著降低腦內TNF-α、IL-1β的表達，證明人參皂苷CK在敗血癥治療尤其是用于敗血癥患者炎癥治療中具有良好的開發(fā)前景。

在局灶性腦缺血再灌注損傷模型中，小膠質細胞亦可被激活，激活的小膠質細胞具有早期損傷和晚期保護雙重作用。在缺血早期，小膠質細胞參與缺血性神經元的損害過程，適當抑制小膠質細胞的過度激活可減少細胞毒性作用和病理損害[14]。本課題通過復制大鼠MACO模型，觀察人參皂苷CK的保護作用。結果表明，人參皂苷CK可顯著減少MCAO致局灶腦缺血大鼠的腦缺血梗死灶體積，對腦缺血引起的小膠質細胞激活的抑制作用可能是其發(fā)揮神經保護作用的機制。

在體外實驗中，原代培養(yǎng)的小膠質細胞可被LPS誘導激活，并釋放出大量ROS，進而發(fā)生氧化應激而影響其炎癥反應性[15]，如導致一些炎癥相關的因子包括誘導型一氧化氮合酶（iNOS）轉錄水平的改變，促進合成NO，發(fā)揮殺傷腫瘤細胞及抵抗細菌、真菌及寄生蟲等感染的作用[16-17]。但iNOS過表達又會引起大量的和長時間的NO釋放，是造成神經細胞損傷的重要原因[18]。人參皂苷CK為原人參二醇型皂苷降解產物，在天然人參中并不存在，是Hasegawa[19]用土壤細菌降解人參皂苷Rb1、Rb2與Rc時發(fā)現(xiàn)的，是原人參二醇型皂苷在體內吸收和發(fā)揮作用的真正實體。有證據(jù)表明，CK對多種炎癥細胞模型的作用優(yōu)于色甘酸二鈉或地塞米松。細胞和分子水平進一步研究發(fā)現(xiàn)，CK下調IL-1β和TNF-α mRNA表達，同時抑制NF-κB及MAPK的活性并可下調NOS與COX-2基因表達，從而減少NO的釋放而發(fā)揮抗炎作用。

本課題中體外實驗證明，人參皂苷CK可抑制LPS誘導的原代培養(yǎng)小膠質細胞的激活，并可顯著降低培養(yǎng)液中NO含量和細胞內ROS含量，證明人參皂苷CK不僅抑制小膠質細胞激活，而且可進一步抑制其激活后氧化應激及炎癥反應，這可能是人參皂苷CK抗炎和神經保護的共同作用機制。體內和體外實驗結果證實，人參皂苷CK具有良好的抗炎和神經保護作用，可抑制小膠質細胞的激活并可抑制細胞因子、炎癥介質等的釋放，為其進一步開發(fā)成為抗炎和神經保護藥物，特別是治療老年癡呆等神經退行性疾病的藥物提供了一定的實驗依據(jù)。

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