劉慶德 王洪旗 姬會春 張 頌 周 燏 朱 云 孫 陽 劉軍權(quán)

解放軍第九七醫(yī)院，江蘇徐州 221004

目前抗乙型肝炎病毒的治療一般采用核苷類似物或/和IFN–α聯(lián)合治療，雖然具有一定的臨床療效，但均難以徹底清除病毒。隨著對抗病毒細胞免疫學與分子生物學的深入研究和對乙型肝炎發(fā)病機理的研究闡明，細胞免疫治療正在成為乙型肝炎治療的一種重要手段。γδT細胞是一種較新型的腫瘤效應(yīng)細胞，國內(nèi)外許多研究證實，人外周血中培養(yǎng)的γδΤ細胞具有較強的抗腫瘤效應(yīng)，但目前對其應(yīng)用于慢性乙型肝炎臨床治療的報道較少。Poccia等[1]報道，γδT細胞在早期的抗病毒免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要的作用。由于γδT細胞僅占外周血淋巴細胞總數(shù)的1%～5%，限制了其臨床應(yīng)用研究。本研究應(yīng)用患者自身外周血單個核細胞（PBMC）在體外用異戊希焦磷酸法刺激PBMCs來特異性擴增γδT細胞，然后將培養(yǎng)成功的細胞回輸給乙型肝炎病毒（HBV）感染患者，通過近期和中長期的隨訪來觀察治療效果。

1 對象與方法

1.1 對象

1.1.1 研究對象 按1995年全國病毒性肝炎診斷標準，選擇160例在第九七醫(yī)院于2005年1月～2012年6月住院與門診病人，其中慢性乙型肝炎89例，乙型肝炎病毒攜帶者71例。女64例，男96例，年齡18～59歲。160例中138例HBV－DNA和HBeAg均陽性，22例僅為 HBV－DNA陽性；所有患者1年內(nèi)均未行抗病毒治療。治療之前均明確告知本治療的優(yōu)點和不足，患者或家屬簽署知情者同意書，并報醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2 試劑 rhIL－2（比活性 40 U/ng）（Promega 公司）；RPMI1640、胎牛血清（Gibico公司）；淋巴細胞分離（Ficoll，1.077）（上海第二制藥廠）；HBeAg酶免檢測試劑盒（山東3V）；乙肝病毒核酸擴增PCR熒光檢測試劑盒（深圳匹基生物工程股份有限公司）。熒光標記的單抗和同型對照抗體 FITC－mIgGI、PE－mIgF2a（DB 公司和 PHarmingen 公司）；FITC 標記的 Anti－TCR－γδ、PE 標記的穿孔素（Perforin）、顆粒酶B（GranB）、NKG2D及Fix&Perm破膜劑（購自ebioscience公司）；IPP（Sigma公司）。 HepG212115細胞購于上海細胞所本室傳代保存。流式細胞儀（美國B.D公司的FACSCaliar，分析軟件為ELITE），Rochelightcycler 熒 光PCR檢測儀（瑞士羅氏公司）。

1.2 方法

1.2.1 γδT細胞的培養(yǎng)和鑒定 用Baxter CS－3000血細胞分離機分離患者PBMC，采集血液總量4 000～5 000 mL，獲取的 PBMC（含有部分紅細胞）數(shù)為 2.0×109～4.5×109，在進行PBMC采集時留取100 mL自身血漿在細胞回輸時應(yīng)用。將采集的PBMC分離出部分血漿應(yīng)用于自身細胞培養(yǎng)，其他細胞懸液用淋巴細胞分離液分離，以1500 r/min離心10 min、離心半徑15 cm，吸取單個核細胞層，用生理鹽水洗滌3次（1500 r/min 離心，10 min/次、離心半徑 15 cm），將細胞用無血清培養(yǎng)基配成1×109/L的細胞懸液（含3%人自身血清、IL－21×105U/L 和 IPP 3 mg/L），加入 GT－T503 細胞培養(yǎng)袋（2000 mL/袋）內(nèi)。收集培養(yǎng)10 d的細胞進行抗人TCR－γδ－FITC表面標志檢測。用于治療的γδT細胞進行細菌和霉菌培養(yǎng)，陰性后收集細胞，用生理鹽水洗滌3次，懸浮于自身血漿中供靜脈回輸。 療程終細胞數(shù) 3.1×109～1.0×1010。

1.2.2 γδT細胞與 HepG212115細胞混合培養(yǎng) 將HepG 212115復(fù)蘇后本實驗室傳代擴增，收集細胞配成密度為1×108/L的細胞懸液 按每孔0.5 mL接種于48孔細胞培養(yǎng)板中，分別加入培養(yǎng)10 d，百分率大于80%的γδT細胞，使其與 HepG212115 細胞的比例分別為 1∶1、5∶1、10∶1、20∶1 和40∶1；各組用含10%胎牛血清和3%AB血清的RPMI1640補充至1 mL。每測試點設(shè)5個復(fù)孔。培養(yǎng)72 h后收集培養(yǎng)上清液0.4 mL，用于HBeAg檢測。

1.2.3 HBeAg和HBV-DNA測定 各項操作步驟按試劑盒說明書進行，HBV－DNA含量用PCR檢測度；HbeAg用酶免治療檢測，結(jié)果以測定孔吸光度值/陰性孔吸光度值（P/N）表示。抑制率按下列公式計算：抑制率（%）=（對照孔P/N值－實驗孔P/N值對照孔P/N值）×100%。

1.2.4 FCM法檢測 培養(yǎng)前后 γδT細胞的 PFP，GraB，NKG2D 收集培養(yǎng)前的PBMC和培養(yǎng)10 d的γδT細胞經(jīng)PBS洗1次，用pH 7.4 PBS調(diào)整細胞密度為1×1010/L。①GraB和perforin檢測：在上述處理好的細胞中每管加入TCR－γδ－FITC 抗體 20 μL，避光孵育 30 min 后分別加入 100 μL anti－GraB－PE 和 anti－PFP－PE。室溫避光孵育 15 min，每管加3 mL PBS洗滌，1500 r/min離心5 min，棄上清。0.5 mL PBS重懸細胞，上機檢測。②NKG2D的檢測：取上述配制好細胞懸液各 100 μL，加入 100 μL 破膜液破膜，加入 TCR－γδ－FITC抗體 20 μL，避光孵育 30 min后分別加入 100 μL anti－NKG2D－PE，室溫孵育 20 min。PBS 2 mL 洗滌，2000 r/min離心5 min，棄上清，0.5 mL PBS重懸細胞，上機檢測。

1.2.5 細胞因子的檢測 收集不同培養(yǎng)時間的γδT細胞，1500 r/min×6 min，RPMC1640洗1次。調(diào)整細胞密度為5×109/L，接種24孔細胞培養(yǎng)板，每孔 2 mL，于 37℃、50 mL/L CO2環(huán)境繼續(xù)用γδT細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后收集細胞，1500 r/min×6 min，各取上清液0.5 mL，用酶免法檢測上清液中的 IL－10、IL－12、INF－γ 和 TNF－α 含量。操作過程嚴格按照說明書進行。每檢測樣本設(shè)5個復(fù)管，取平均值。

1.3 治療方案

每周回輸γδT細胞2次，連續(xù)治療8～12次為1個療程，回輸細胞總數(shù)為3.1×1010～9.0×1010。除少數(shù)患者病情有反復(fù)者6個月后進行第2次療程外，其他患者均在12個月后行第2次治療。160例患者中接受1個療程治療有81例，2個療程治療45例，3個療程治療有15例，4個療程以上有19例。

1.4 觀察指標

治療前后及隨訪時檢查HBV－DNA、HBeAg和肝功能。

1.5 療效判斷

根據(jù)HBeAg與HBV－DNA結(jié)果進行療效評估，顯效：HBeAg與HBV－DNA均轉(zhuǎn)陰；有效：HBeAg與HBV－DNA有一項轉(zhuǎn)陰；無效：HBeAg與HBV－DNA無變化。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以均值±標準差（±s）表示。組與組之間的比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 γδT 細胞培養(yǎng)和鑒定

PBMC在γδΤ細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h即可見細胞集落生長，每個集落約2～3個細胞，72 h后集落開始變大，培養(yǎng)10 d可見大的集落和部分散在生長細胞。培養(yǎng)10 d的γδΤ細胞涂片行瑞姬染色可見細胞體積大，呈橢圓或不規(guī)則形，細胞核大多為橢園或園形，核染質(zhì)疏松，核膜不規(guī)則，有凸起；胞質(zhì)豐富，染成灰蘭色，形態(tài)不規(guī)則。收集培養(yǎng)前的PBMC和培養(yǎng)10 d的γδT細胞進行流式細胞檢測，結(jié)果見圖1、2。培養(yǎng)前γδT細胞數(shù)為3.12%，培養(yǎng)10 d時γδT細胞數(shù)為90.46%。

2.2 γδT細胞對HepG212115細胞中的HBeAg表達的影響

γδT 細胞分別以 1∶1、5∶1、10∶1、20∶1 和 40∶1 的比值與HepG212115細胞共培養(yǎng)72 h。結(jié)果顯示，2種細胞共培養(yǎng)后對HepG212115細胞中的HBeAg的表達有顯著的抑制作用。隨細胞比值增加，抑制率逐漸增強。見圖3。

2.3 PBMC培養(yǎng)前后γδT細胞穿孔素、粒酶B和NKG2D結(jié)果

不同培養(yǎng)時間γδT細胞穿孔素、粒酶B和NKG2D結(jié)果有明顯差異。培養(yǎng)8d的γδT細胞穿孔素、粒酶B和NKG2D分別為62.8%、72.7%和60.8%，顯著高于培養(yǎng)前的PBMC（分別為0.18%、1.10%和1.30%）。結(jié)果見表1和圖4、5。

2.4 不同培養(yǎng)時間細胞培養(yǎng)上清中細胞因子結(jié)果

不同培養(yǎng)時間的γδT細胞所分泌的細胞因子結(jié)果見表2。四種細胞因子結(jié)果在各培養(yǎng)時間段有一定的差異，IFN－γ和TNF－α含量在培養(yǎng)9 d時高于其他組，組間比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。IL－10和IL－12分泌量各組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 患者PBMC培養(yǎng)前后γδT細胞穿孔素、粒酶B和NKG2D結(jié)果（%，±s）

表1 患者PBMC培養(yǎng)前后γδT細胞穿孔素、粒酶B和NKG2D結(jié)果（%，±s）

注：與相同檢測項目的0 d比較，*P＜0.05，△P＜0.01

培養(yǎng)天數(shù) 例數(shù) γδTCR總數(shù) 穿孔素 粒酶B NKG2D 0 d 2 d 4 d 6 d 8 d 10 10 10 10 10 5.3±2.3 12.5±5.1*32.4±7.1△76.3±9.5△79.3±14.6△0.3±0.1 8.4±2.7*32.5±2.8△49.6±3.9△62.7±4.6△1.2±0.3 9.3±2.7*24.4±3.6△65.5±3.7△72.2±5.8△1.4±0.2 4.5±0.7*32.1±3.5△61.2±7.2△60.2±8.5△

2.5 治療后血清中HBeAg和HBV-DNA轉(zhuǎn)陰情況

治療前138例HBeAg陽性者，治療后有76例HBeAg（55.10%）轉(zhuǎn)陰。160例HBV－DNA陽性者治療后有82例轉(zhuǎn)陰，轉(zhuǎn)陰率為51.25%。按療效判斷標準，顯效51.88%（83/160），有效25.63%（41/160），無效 20.85%（26/160），總有效率為77.51%。

表2 γδT細胞上清液中細胞因子結(jié)果（ng/L，±s，n=10）

表2 γδT細胞上清液中細胞因子結(jié)果（ng/L，±s，n=10）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；IFN－γ：干擾素－γ；IL－10：白介素－10；IL－12：白介素－12；TNF－α：腫瘤壞死因子－α

培養(yǎng)時間 IFN－γ IL－10IL－12 TNF－α 0 d 3 d 6 d 9 d 12 d 183.3±18.9 216.9±17.7a 277.4±18.1a 295.6±19.3a 228.3±17.9a 42.2±3.6 36.2±2.9 44.2±3.2 41.2±3.6 40.3±3.7 35.8±2.7 43.1±3.4 42.2±3.6 37.9±3.9 35.7±2.7 236.2±21.1 288.3±27.3a 263.7±26.4a 283.7±25.7a 196.5±22.3a

2.6 隨訪結(jié)果

經(jīng)3個月～5年隨訪，HBeAg轉(zhuǎn)陰者由治療結(jié)束時的76例增至 87例，轉(zhuǎn)陰率為 60.0%（96/160），HBV－DNA 轉(zhuǎn)陰者由82例增至112例，轉(zhuǎn)陰率為70.0%（112/160）。

2.7 毒副反應(yīng)

21例在回輸后出現(xiàn)低熱，經(jīng)對癥處理后24 h降至正常。

3 討論

乙肝病毒的持續(xù)感染是造成乙肝慢性化的主要原因，且可導(dǎo)致病情發(fā)展、惡化至肝硬化和HBV相關(guān)性肝細胞癌。由于慢性乙肝病毒感染者的機體免疫狀態(tài)失衡，機體免疫系統(tǒng)對抗病毒產(chǎn)生耐受。因此，抗病毒治療是慢性乙肝治療的關(guān)鍵。國內(nèi)在對乙肝發(fā)病機制的研究中發(fā)現(xiàn)，宿主免疫細胞數(shù)量減少或功能低下、不能有效清除病毒是導(dǎo)致乙肝慢性化的重要原因之一[3]。當前各種藥物和治療方法均不能有效清除已經(jīng)整合到肝細胞內(nèi)的乙肝病毒。隨著細胞免疫學和分子生物學對乙肝發(fā)生發(fā)展機制的闡明，發(fā)現(xiàn)細胞免疫在機體抗病毒感染免疫中占主導(dǎo)地位，起著重要的作用。因此，提高機體的T淋巴細胞和抗原提呈細胞的細胞免疫功能及增加協(xié)同細胞因子等多種方法聯(lián)合對于清除病毒、打破免疫耐受將起到重要的作用。

γδT細胞是廣泛分布于黏膜上皮組織內(nèi)的固有免疫T細胞，它的抗腫瘤效應(yīng)除了有與αβT細胞類似的一些功能特征外，γδT細胞能夠以MHC分子非限制的方式識別磷酸化的小分子抗原如IPP、熱休克蛋白等，活化后表達CD80、CD86等協(xié)同刺激分子，可參與抗原遞呈，替代樹突狀細胞的功能[4－5]，γδT細胞識別多肽抗原時無MHC限制，而且還能識別一些非多肽抗原[6－7]。γδT細胞是一種固有免疫效應(yīng)細胞，有研究發(fā)現(xiàn)，活化的γδT細胞具有抗感染、抗腫瘤作用[8－10]。γδT細胞還可以維持免疫耐受，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，參與自身免疫性疾病的發(fā)生。盡管γδT細胞在人外周血中數(shù)量較少，但卻具有的重要免疫學功能。目前有許多用人外周血中培養(yǎng)的γδΤ細胞進行抗腫瘤細胞報道[11－13]，但應(yīng)用于慢性乙型肝炎臨床治療的研究少見報道。我們在前期進行的小樣本病例試治的基礎(chǔ)上[3]，進行了大綜病例的臨床治療，取得了一定療效。

Yin等[13]實驗結(jié)果表明，γδT細胞還能夠分泌多種細胞因子，在培養(yǎng)的上清液中細胞因子IFN－γ分泌明顯增高，這與我們的實驗結(jié)果相似。另外，我在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，γδT細胞和 HepG212115細胞混合培養(yǎng)后，對 HepG2 12115細胞中的HBeAg的表達有顯著的抑制作用[7]，并隨著誘導(dǎo)的細胞比值增加和時間延長，抑制率逐漸增加，且高濃度比低濃度作用更為明顯。不同密度的γδT細胞與HepG212115細胞混合培養(yǎng)后上清液中HBV-DNA也有較為顯著的下降，最多能下降約2個對數(shù)值，以上結(jié)果與Sells等[14]報告的一致。這些研究說明，γδT細胞能夠有效的抑制HBV-DNA的復(fù)制及HBeAg的表達，發(fā)揮抗病毒效應(yīng)。筆者用體外培養(yǎng)的的自身γδT細胞回輸治療HBV感染者也取得了一定的臨床療效，進行治療的160例HBV感染者治療后血清HBV-DNA轉(zhuǎn)陰者由82例增至112例，轉(zhuǎn)陰率為 70.0%（112/160），HBeAg轉(zhuǎn)陰率為 60.0%（96/160），治療后總有效率為77.51%。

應(yīng)用γδT細胞治療慢性乙型肝炎的確切機理尚不清楚，可能與下列內(nèi)容有關(guān)：①γδT細胞對細菌和病毒感染的細胞能快速應(yīng)答且不需抗原提呈，且無MHC限制性。因此，取患者自身PBMC經(jīng)體外激活和擴增然后回輸給患者可以直接殺傷被乙型肝炎病毒感染的靶細胞。②γδT細胞可能分泌多種細胞因子，尤其是γ-INF在抗病毒的合成具有重要作用，另外還能分泌GM-CSF和TNF等細胞因子，這些細胞因子能抑制病毒的復(fù)制[14-16]，本研究培養(yǎng)的γδT細胞分泌IFN-γ和TNF量明顯高于培養(yǎng)前。③乙型肝炎感染患者的PBMC經(jīng)IPP和IL-2活化和擴增后的γδT細胞高表達穿孔素、粒酶B和NKG2D，因為穿孔素、顆粒酶B是殺傷性T淋巴細胞中的主要活性物質(zhì)，與T細胞活化以后脫顆粒過程相關(guān)，其比值可以直接反應(yīng)該效應(yīng)細胞具有的特異性殺傷活性。γδTCR刺激物（如甲羥戊酸途徑代謝物IPP）刺激后γδT細胞的NKG2D表達與NKG2D相關(guān)的調(diào)脂蛋白A/B及Toll樣受體及效應(yīng)細胞相關(guān)的受體有關(guān)，如MHC A、B，MHCⅠb和F1-AYP合酶以及黏附分子如ICAM-1等的表達水平密切相關(guān)[17]。

有關(guān)過繼性免疫治療尚無統(tǒng)一方案。筆者認為回輸細胞總數(shù)應(yīng)＞1×1010可能才能具有治療作用。將γδT細胞回輸治療與其他藥物應(yīng)用相結(jié)合，增加細胞和某些細胞因子（如干擾素、IL-2）用量及某些藥物如核苷類似物等聯(lián)合應(yīng)用可能會取得更好效果。從本實驗結(jié)果表明，用γδT細胞治療慢性乙肝具有一定的應(yīng)用前景。

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