隋 淼 王曉波 襲榮剛 孫佳丹

1.解放軍第二一〇醫(yī)院國家藥物臨床試驗機構(gòu)，遼寧大連 116021；2.大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧大連 116015

泮托拉唑鈉為胃壁細胞質(zhì)子泵抑制劑，在中性和弱酸性條件下相對穩(wěn)定，在強酸性條件下迅速活化，其pH 依賴的活化特性，使其對H+-K+-ATP 酶的作用具有更好的選擇性。本品能特異性地抑制壁細胞頂端膜構(gòu)成的分泌性微管和胞漿內(nèi)的管狀泡上的H+-K+-ATP 酶，引起該酶不可逆性的抑制，從而有效地抑制胃酸的分泌。由于H+-K+-ATP 酶是壁細胞泌酸的最后一個過程，故本品抑酸能力強大。它不僅能非競爭性抑制促胃液素、組胺、膽堿引起的胃酸分泌，而且能抑制不受膽堿或H2受體阻斷劑影響的部分基礎(chǔ)胃酸分泌。本品與其他藥物配伍用時，具有藥物間相互作用小的優(yōu)點。本品通過肝細胞內(nèi)的細胞色素P450 酶系的第Ⅰ系統(tǒng)進行代謝，同時也可以通過第Ⅱ系統(tǒng)進行代謝。當(dāng)與其他通過P450 酶系代謝的藥物配伍使用時，本品的代謝途徑可以通過第Ⅱ酶系統(tǒng)進行，從而不易發(fā)生藥物代謝酶系的競爭性作用，減少體內(nèi)藥物間的相互作用。無致突變、致癌和致畸作用。本文采用高效液相色譜（HPLC）法測定健康人群血漿中泮托拉唑鈉的含量，并進行藥動學(xué)研究，從而為臨床應(yīng)用提供藥動學(xué)參考數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-10ATvp 高效液相色譜儀，SPD-10Avp 紫外檢測器，AUW120D分析天平（均為日本島津公司），N2000 色譜數(shù)據(jù)工作軟件（浙江大學(xué)智達信息工程有限公司），F(xiàn)A1004電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司），JA2003N 電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；TGL-16G 臺式高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XW-80A 微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；KS 康式振蕩器 （江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；MTN-2800W 氮吹濃縮儀（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）；pHS-25 數(shù)字酸度計（上海偉業(yè)儀器廠）。

1.2 試藥

泮托拉唑鈉腸溶片試驗制劑（規(guī)格：40 mg/片，按泮托拉唑計算，貴州保和堂制藥有限公司），泮托拉唑鈉腸溶片（泰美尼克，規(guī)格：40 mg/片，沈陽東宇藥業(yè)，批號：080901）；泮托拉唑鈉標準品、非那西丁標準品內(nèi)標物（均由中國藥品生物制品檢定所提供）；甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚為色譜純，其余均為分析純，二次重蒸水；空白人血漿（由解放軍第二一〇醫(yī)院輸血科提供）。

2 方法與結(jié)果

2.1 受試者選擇采用雙周期自身隨機交叉試驗設(shè)計

選擇健康受試者20例，男、女各10例，平均年齡（26.7±1.5）歲，平均體重（57.7±4.8）kg，平均身高（155.7±3.7）cm。體格檢查示肝、腎功能無異常，不吸煙、嗜酒。女性健康受試者受試期間避開月經(jīng)、妊娠及哺乳期。試藥前2周內(nèi)未服用任何其他藥物。臨床試驗方案經(jīng)解放軍第二一〇醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。

2.2 試驗方案

20 名試驗者隨機等分為兩組，每組試驗者每次試驗時分別服用泮托拉唑鈉腸溶片試驗制劑或參比制劑。試驗者于試驗前一日晚餐后，禁食不禁水12 h，次日清晨空腹分別單次口服泮托拉唑鈉腸溶片試驗制劑和參比制劑40 mg，以200 mL 溫開水送服，并作記錄。服藥2 h 后可自由飲水，服藥4 h 后進統(tǒng)一清淡低脂飲食。試驗期間由醫(yī)護人員進行監(jiān)護。間隔7 d 后交叉給藥，重復(fù)上述試驗。服藥期間禁煙、酒和含咖啡因類飲料，避免劇烈運動和長時間臥床。

2.3 血樣采集

受試者于服藥前（0 h）和服藥后 0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h，取肘靜脈血 5 mL，置肝素化試管中 （采血過程避光），4.0×103r/min 離心5 min，分離血漿，置-70℃冰箱保存待測。

2.4 血藥濃度測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18 柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；預(yù)柱：琛航 C18保護柱；流動相：磷酸鹽緩沖液[磷酸調(diào) pH 為（3.60±0.02）]-乙腈（65∶35）；檢測波長：288 nm；柱溫：30℃；流速：1.2 mL/min；進樣量：20 μL。

2.4.2 標準溶液的配制 精密稱取泮托拉唑鈉對照品27.69 mg（相當(dāng)于泮托拉唑24.77 mg），置50 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成濃度為495.4 μg/mL 的泮托拉唑儲備液。用甲醇-水（1∶1）稀釋儲備液配制泮托拉唑系列標準溶液和質(zhì)控標準溶液。過程見表3 所示（以上過程均嚴格避光操作）。精密稱取非那西丁對照品10.12 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成濃度為101.2 μg/mL的內(nèi)標儲備液；精密量取5.0 mL 內(nèi)標儲備液，置50 mL 量瓶中，用甲醇-水（1∶1）稀釋至刻度，制成濃度為 10.1200 μg/mL的內(nèi)標溶液（以上過程均嚴格避光操作）。

2.4.3 樣品預(yù)處理 精密量取血漿樣品500 μL，依次加入甲醇-水（1∶1）50 μL，內(nèi)標溶液（10.1200 μg/mL 非那西丁溶液）50 μL，2%氨水 200 μL，甲基叔丁基醚 3 mL，渦旋混合30 s，振蕩 10 min，離心 6 min（15 000 r/min），移取上層有機層置另一試管中，在40℃水浴，空氣流下吹干，殘留物以35%乙腈100 μL 復(fù)溶，渦旋混合60 s，移置 1.5 mL 離心管中，離心 3 min（15 000 r/min），取上清液 20 μL 進樣分析（以上過程均嚴格避光操作）。

2.5 方法專屬性

色譜條件下，藥物、血漿中的內(nèi)源性雜質(zhì)和內(nèi)標物分離完全，峰形良好，色譜見圖1。非那西丁保留時間為6.0 min，泮托拉唑保留時間為7.2 min，分離度大于1.5，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾泮托拉唑和內(nèi)標物非那西丁的測定。

圖1 血漿中泮托拉唑高效液相色譜圖

2.6 標準曲線的制備與定量下限

精密量取空白血漿500 μL，分別加入泮托拉唑系列標準溶液50 μL，配制成血漿中泮托拉唑濃度為19.8，49.5，99.1，198.2，495.4，990.8，2972.4，5944.8 ng/mL 的 血 漿 樣 品 ，按“2.4.3”項下同法試驗，每一濃度進行雙樣本分析，制備泮托拉唑的標準曲線。以待測物濃度（ng/mL）為橫坐標X，待測物與內(nèi)標物的峰面積比值（AS/Ai）為縱坐標Y，用加權(quán)最小二乘法[3]進行線性回歸，求得血漿標準曲線方程：Y=0.003 11X-0.002 69，r=0.9999 線性范圍為 19.8～5944.8 ng/mL。血漿中泮托拉唑定量下限為19.8 ng/mL。

2.7 回收率與精密度試驗

取空白離心管分別加入不同濃度的泮托拉唑質(zhì)控標準溶液 50 μL，再加入空白血漿 500 μL，配制成低、中、高（39.6，396.3 和 4954.0 ng/mL）3個 濃 度 的 血 漿 樣 品 ，按“2.4.3”項下同法試驗，在不同天的時間內(nèi)連續(xù)制備并測定3個分析批，每批樣品分為低、中、高3個濃度水平，每個濃度進行6 樣本分析。計算日內(nèi)和日間精密度。見表1。

另取對應(yīng)濃度的泮托拉唑質(zhì)控標準溶液各50 μL，分別加入非那西丁內(nèi)標溶液 （10.1200 ng/mL 非那西丁溶液）50 μL（每濃度 6 樣本分析），渦旋混合 30 s，取 20 μL 上清液進樣分析，獲得相應(yīng)色譜峰面積（6次測定的平均值）。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計算提取回收率。結(jié)果表明，泮托拉唑血漿樣品的提取回收率符合有關(guān)規(guī)定[1]，內(nèi)標提取回收率穩(wěn)定。提取回收率為69.0%～73.7%。

2.8 穩(wěn)定性

取空白血漿500 μL分別加入不同濃度泮托拉唑質(zhì)控標準溶液50 μL，配制成血漿中泮托拉唑濃度為39.6 和4954.0 ng/mL 的血漿樣品（每濃度3 樣本分析）的血漿樣品若干份，一份按“血漿樣品處理方法”項下同法試驗，在室溫放置24 h 后進樣分析，考察預(yù)處理后血漿樣品在室溫條件下的穩(wěn)定性；一份加入標準溶液在室溫放置24 h 后，按“血漿樣品處理方法”項下操作，進樣分析，考察血漿樣品在室溫條件下的穩(wěn)定性；一份加入標準溶液在室溫放置6 h 后，按“2.4.3”項下同法試驗，進樣分析，考察血漿樣品在室溫條件下的穩(wěn)定性；另一份于-20℃冰箱冷凍，反復(fù)凍融3次后，按“2.4.3”項下同法試驗，進樣分析，考察血漿樣品經(jīng)3次反復(fù)凍融穩(wěn)定性；一份于-20℃冷凍保存80 d 后，按“2.4.3”項下同法試驗，進樣分析，考察血漿樣品在長期冷凍條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，質(zhì)控樣品測定結(jié)果均符合有關(guān)規(guī)定[1]。見表2。

表1 泮托拉唑精密度與回收率試驗結(jié)果

表2 泮托拉唑穩(wěn)定性試驗結(jié)果（±s，n=3）

表2 泮托拉唑穩(wěn)定性試驗結(jié)果（±s，n=3）

穩(wěn)定性檢測血漿樣品濃度39.6 ng/mL測得量（ng/mL） RSD（%）4954.0 ng/mL測得量（ng/mL） RSD（%）新鮮配制室溫6 h室溫24 h冷凍48 h反復(fù)凍融3次80 d 39.2±1.3 35.3±0.6 39.4±1.3 40.8±2.5 41.9±1.1 43.0±0.9 3.4 1.8 3.4 6.0 2.7 2.0 5170.6±136.7 4978.0±31.7 5156.0±194.9 5318.1±103.3 4830.6±176.0 5178.1±96.0 2.6 0.6 3.8 1.9 3.6 1.9

2.9 結(jié)果

2.9.1 血藥濃度-時間曲線20名健康受試者口服泮托拉唑鈉腸溶片受試制劑和泮托拉唑鈉腸溶片參比制劑后的血藥濃度-時間曲線均數(shù)對比圖，見圖2。

圖2 20例受試者口服受試制劑和參比制劑后泮托拉唑的平均血藥濃度-時間曲線均數(shù)對比圖

2.9.2 藥代動力學(xué)參數(shù) 采用WinNonlin 5.2.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件，計算20例受試者口服受試制劑或參比制劑后泮托拉唑的藥代動力學(xué)參數(shù)。見表3。

表3 兩制劑動力學(xué)參數(shù)（±s，n=20）

表3 兩制劑動力學(xué)參數(shù)（±s，n=20）

參數(shù) 試驗制劑參比制劑tmax（h）Cmax（ng/mL）AUC0-t（ng/mL·h）AUC0-∞（ng/mL·h）t1/2（h）2.8±0.6 2985.6±641.2 9682±4478 10019±4876 1.83±0.56 2.9±0.8 3231.4±923.5 9388±4125 9627±4156 1.96±0.52

2.9.3 生物等效性檢驗 對主要藥代動力學(xué)參數(shù)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行方差分析，并進一步采用雙單側(cè)t檢驗和[1-2α]置信區(qū)間法進行生物等效性評價，其中tmax采用非參數(shù)檢驗法。結(jié)果表明，泮托拉唑鈉腸溶片受試制劑的AUC0-t、AUC0-∞和Cmax均拒絕生物不等效假設(shè)。受試制劑中，泮托拉唑AUC0-t的90%置信區(qū)間為參比制劑的92.7%～112.2%，AUC0-∞的90%置信區(qū)間為參比制劑的92.2%～112.6%，Cmax的90%置信區(qū)間為參比制劑的85.6%～104.3%，tmax在受試制劑與參比制劑間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

根據(jù)以上結(jié)果判定，貴州保和堂制藥有限公司提供的泮托拉唑鈉腸溶片（受試制劑，規(guī)格：40 mg/片，按泮托拉唑計算）與沈陽東宇藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的泮托拉唑鈉腸溶片（參比制劑，商品名：泰美尼克，規(guī)格：40 mg/片，按泮托拉唑計算）具有生物等效性。

3 討論

本試驗所建立的高效液相色譜法測定人體血漿中泮托拉唑的濃度[1-6]，具有分析時間短、操作簡便、靈敏度高等特點，適用于泮托拉唑鈉腸溶片人體生物等效性研究。

受試制劑和參比制劑均為腸溶片，檢測結(jié)果顯示受試制劑及參比制劑的tmax均在2.8 h 左右，前兩個取血點大部分未檢測出泮托拉唑的血藥濃度，完全符合腸溶片的特點。通過本實驗檢測結(jié)果統(tǒng)計的Cmax及t1/2 值可知，采樣持續(xù)時間滿足3～5個半衰期及所檢測到的末點血藥濃度滿足Cmax的1/20 的要求。

采用WinNonlin 5.2.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件，對藥代動力學(xué)參數(shù)進行計算，受試制劑與參比制劑的藥代動力學(xué)參數(shù)與文獻[7-15]報道基本一致。以貴州保和堂制藥有限公司提供的泮托拉唑鈉腸溶片為受試制劑，以AUC0-t計算，與參比制劑相比泮托拉唑的相對生物利用度為 （104.9±26.1）%。對泮托拉唑的主要藥代動力學(xué)參數(shù)進行方差分析表明，兩制劑的Cmax、AUC 經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后，在制劑間、周期間均無顯著性差異，兩制劑具有生物等效性。

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