周修騰， 何 偉， 李 勇， 顏慷祺

(1.廣東藥學(xué)院藥物研究所廣東省藥物新劑型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510006;2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局“高脂血癥調(diào)肝降脂重點(diǎn)研究室”國(guó)家中醫(yī)藥管理局脂代謝實(shí)驗(yàn)室 (三級(jí))廣東省代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東藥學(xué)院中醫(yī)藥研究院，廣東廣州510006)

杜仲系杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv．的干燥樹皮，具補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨、安胎之功效［1］，主要化學(xué)成分有松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、杜仲膠等［2-4］，松脂醇二葡萄糖苷為主要特征性成分［5］。因此，松脂醇二葡萄糖苷的含有量高低是評(píng)價(jià)杜仲藥材質(zhì)量的重要依據(jù)［6］。

杜仲含有大量的杜仲膠，是影響杜仲松脂醇二葡萄糖苷定量測(cè)定的主要因素之一［5］。因此，《中國(guó)藥典》2010年版一部杜仲項(xiàng)下含量測(cè)定方法，首先以三氯甲烷為溶劑，采用索氏回流提取法處理杜仲藥材，以除去杜仲膠，但提取時(shí)間長(zhǎng)達(dá)12 h，且三氯甲烷屬于中等類有毒溶劑，對(duì)人體損害大［7］。故本研究采用“石油醚除膠-甲醇提取”法測(cè)定杜仲松脂醇二葡萄糖苷，并進(jìn)行了方法學(xué)研究。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 DIONEX Ultimate 3000高效液相色譜儀，含四元梯度泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD二極管陣列檢測(cè)器，Chromeleon 6.8色譜工作站(美國(guó)戴安公司);BT—224S型萬分之一電子分析天平 (北京Sartorius);BT—125D型十萬分之一電子分析天平 (北京Sartorius);DFY—500型搖擺式高速中藥粉碎機(jī) (溫嶺市林大機(jī)械有限公司);UNIPREP 24(德國(guó) UNIEQUIP)，ULTRA-GE-MK2純水儀。

1.2 試劑 松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品 (批號(hào):110807-200205，定量測(cè)定用)，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;杜仲購(gòu)于廣州致信藥業(yè)有限公司(批號(hào)分別為111001-111005)，經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院李書淵教授鑒定，符合2010年版《中國(guó)藥典》一部杜仲項(xiàng)下規(guī)定;液相用甲醇為色譜純，其余試劑為分析純，超純水自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相為甲醇-水 (25∶75);檢測(cè)波長(zhǎng)277 nm;柱溫30℃;體積流量 1.0 mL/min;進(jìn)樣量10μL。在此色譜條件下，松脂醇二葡萄糖苷峰與其它組分峰達(dá)到基線分離。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品12.49 mg，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，即得質(zhì)量濃度為1.249 mg/mL的對(duì)照品貯備液;精密吸取貯備液1.0 mL于5 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

2.3.1 除杜仲膠方法考察 取杜仲藥材約3 g，粉碎成絮狀，精密稱定質(zhì)量，加入石油醚30 mL，80℃水浴加熱回流2次，每次2 h，趁熱濾過，濾液冷至室溫，置－20℃冰箱中冷藏1 h，析出杜仲膠沉淀，濾過，棄去濾液，沉淀揮干石油醚，精密稱定質(zhì)量，計(jì)算杜仲膠得率。

2.3.2 提取時(shí)間考察 參考相關(guān)文獻(xiàn)［8］及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)提取溫度為80℃時(shí)，杜仲膠在石油醚中的溶解度最大，故固定石油醚提取溫度為80℃，料液比為1∶10，提取次數(shù)為2次，考察提取時(shí)間分別為1 h、2 h、3 h時(shí)杜仲膠得率。從表1可以看出，提取1 h，杜仲膠得率較低;提取時(shí)間超過2 h后，杜仲膠得率變化不明顯，故將提取時(shí)間確定為2 h。

表1 提取時(shí)間對(duì)杜仲膠回收率的影響Tab.1 Effects of extraction time to solvent on extraction yield of the gum

2.3.3 料液比考察 固定提取時(shí)間為2 h，提取次數(shù)為2次，水浴提取溫度為80℃，考察料液比分別為1∶8、1∶10、1∶12時(shí)杜仲膠得率 (見表2)。從表2可以看出，料液比為1∶10時(shí)，杜仲膠得率最高。

結(jié)果表明，以石油醚為溶劑，80℃回流提取2次，每次2 h，料液比為1∶10時(shí)，杜仲膠得率較高，在該條件下除杜仲膠較為理想。

表2 料液比對(duì)杜仲膠回收率的影響Tab.2 Effects of radios of raw material to solvent on extraction yield of the gum

2.3.4 松脂醇二葡萄糖苷提取工藝條件考察 取杜仲藥材約3 g，粉碎成絮狀，精密稱定質(zhì)量，加入石油醚30 mL，80℃水浴加熱回流2次，每次2 h，趁熱濾過，棄去濾液，藥渣加甲醇提取，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響松脂醇二葡萄糖苷提取率的主要因素:甲醇體積分?jǐn)?shù) (A)、提取時(shí)間 (B)、提取次數(shù) (C)、甲醇用量 (D)進(jìn)行考察。每個(gè)因素選取3個(gè)水平，因素水平見表3。以松脂醇二葡萄糖苷量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，并采用SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析，結(jié)果見表4、5。

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of orthogonal tests

由極差、方差分析可知，影響松脂醇二葡萄糖苷提取效果因素大小順序排列為:甲醇體積分?jǐn)?shù)(A)＞提取時(shí)間 (B)＞甲醇用量 (D) ＞提取次數(shù) (C)，其中 C為誤差項(xiàng);經(jīng)F檢驗(yàn)可知，A相對(duì)于誤差項(xiàng)C有顯著性差異 (P＜0.05)，而B、D差異并不顯著 (P＞0.05)，其中A1＞A2＞A3，B2＞B1＞B3，C2＞C3＞C1，D2＞D3＞D1，因此，松脂醇二葡萄糖苷最佳提取條件為A1B2C2D2，即15倍量純甲醇提取2次，每次2 h。

表5 方差分析結(jié)果Tab.5 Analysis of variance

按優(yōu)選工藝，取同一批次的藥材，平行三份，重復(fù)操作，在2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果，杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.326 8 mg/g。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液2、5、10、15、20、30μL，注入液相色譜儀中，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積積分值，以松脂醇二葡萄糖苷微克數(shù)為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為:Y=9.577 0X－0.113 5，r=0.999 9，表明松脂醇二葡萄糖苷在0.499 6μg～7.494μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密量取松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品溶液10μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，同法平行操作6次，測(cè)定松脂醇二葡萄糖苷峰面積，其RSD為0.73%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取同一批次樣品 (批號(hào)111001)3 g，按優(yōu)選提取條件制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別于0、2、4、8、12、24 h各進(jìn)樣10μL，測(cè)定松脂醇二葡萄糖苷峰面積，其RSD為1.55%(n=6)，表明供試品溶液在本試驗(yàn)條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批次樣品 (批號(hào)111001)3 g，平行6份，按照2.3.4項(xiàng)下條件制備供試品溶液，精密吸取10μL，注入液相色譜儀中，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，所得RSD為1.93%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，精密稱取已知含有量的杜仲藥材絮狀粉末，加入松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品溶液2 mL(質(zhì)量濃度0.249 8 mg/mL)，按2.3.4項(xiàng)下條件制備供試品溶液，精密吸取10μL，注入液相色譜儀中，測(cè)定松脂醇二葡萄糖苷峰面積，計(jì)算含有量及回收率。見表6。

表6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)Tab.6 Results of recovery tests(n=6)

2.9 改進(jìn)法與藥典法［1］比較 結(jié)果見表7。

表7 改進(jìn)法與藥典法測(cè)定結(jié)果Tab.7 Com parison of the determ ination of improved methods and China pharmacopoeia(2010)

3 討論

3.1 改進(jìn)法測(cè)得杜仲藥材中松脂醇二葡萄糖苷含有量高于藥典法，究其原因可能是石油醚除杜仲膠效果更好。杜仲膠是一種反式-聚異戊二烯結(jié)構(gòu)［9］，主要以兩種晶體結(jié)構(gòu)共存形式存在，α晶型的熔點(diǎn)為65℃，β晶型為55℃，加熱可使結(jié)晶態(tài)的杜仲膠破壞其晶格而溶解在溶劑中，且杜仲膠晶體完全熔融的溫度需達(dá)65℃以上，但三氯甲烷沸點(diǎn)61.15℃，小于杜仲膠的熔融溫度，石油醚 (60～90℃)具有與杜仲膠晶體熔點(diǎn)相一致的溫度范圍，能夠更徹底地除去杜仲膠［8］。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，采用石油醚提取杜仲膠的得率高于三氯甲烷，很好地證明了石油醚是提取杜仲膠非常理想的溶劑［8，10］，除膠更完全。

3.2 測(cè)定杜仲膠得率時(shí)，石油醚提取液需在－20℃冷凍1 h杜仲膠才能沉淀完全，原因是杜仲藥材粉碎后得到的杜仲膠在較低溫度下溶解度低，膠析出更徹底［11］。

3.3 按《中國(guó)藥典》2010年版杜仲含量測(cè)定項(xiàng)下條件，松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品和供試品用甲醇稀釋后注入色譜儀其峰形出現(xiàn)了拖尾現(xiàn)象，故改進(jìn)法中將松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品及供試品采用流動(dòng)相進(jìn)行稀釋，其峰形較好，且分離度高。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部［S］．北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:154．

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