趙曉曉， 蔡 宇， 蔡天革

(1.暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510632;2.遼寧大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽110036)

山蘆桑顆粒劑由山藥、蘆根、桑椹、大棗等六味藥材組成，具有增強免疫的作用，其主要有效部位為多糖。本實驗采用超聲提取方法提取該復(fù)方有效部位，為進(jìn)一步制備成顆粒劑提供基礎(chǔ);通過單因素試驗及正交試驗［1-2］優(yōu)選其提取工藝，采用苯酚-硫酸法［3］測定多糖量，以評價其提取工藝的合理性。

1 儀器與試劑

TU—1810S紫外-可見分光光度計 (北京普析通用儀器有限公司);SHZ—D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 (鞏義市英峪予華儀器廠);DZF—6050型真空干燥箱 (上海精宏設(shè)備有限公司);KQ—500E型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);DLSB—5/10型低溫冷卻液循環(huán)泵 (鄭州長城科工貿(mào)有限公司);EYELA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海愛朗儀器有限公司);山藥、蘆根、桑椹、大棗等六味藥材均購自廣州二天堂藥店;無水乙醇、丙酮等試劑均為分析純，水為純凈水。

2 實驗方法

2.1 多糖的提取工藝 按處方量稱取藥材，加入一定量的水，超聲提取，合并提取液，離心 (3 600 r/min，15 min，4℃)，取上清液濃縮至相對密度0.8，加入適量95%乙醇使含醇量達(dá)到75%，冰箱靜置過夜。過濾，沉淀分別用丙酮和無水乙醇交替洗滌，干燥，即得到粗多糖。

2.1.1 單因素試驗 以該復(fù)方中多糖量為考察指標(biāo)，分別考察超聲功率、加水量、提取時間、提取溫度對提取得到的多糖量的影響。

2.1.2 正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定正交試驗因素水平，進(jìn)行正交試驗。

2.2 多糖的測定

2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱定已干燥的無水葡萄糖100 mg，置于100 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度。精密吸取5.0 m L于50 m L量瓶中，加水定容至刻度，即得0.1 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 5%苯酚溶液的配制 稱取苯酚5 g于100 mL棕色量瓶中，加水充分溶解并定容至刻度，即得。

2.2.3 供試品溶液的配制 精密稱定已干燥的粗多糖樣品10 mg于100 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，即得供試品溶液。

2.2.4 最大吸收波長的測定 精密吸取蒸餾水2.0 m L，加入5%苯酚溶液1.0 mL，迅速加入硫酸5.0 mL，搖勻，80℃水浴中加熱15 min，取出，冷卻，作為空白對照置于200～800 nm內(nèi)調(diào)零。精密吸取對照品溶液和供試品溶液，加水補至2.0 mL，同上操作，在200～800 nm波長范圍內(nèi)掃描，供試品溶液和對照品溶液均在490 nm處有最大吸收，因此，最終確定最大吸收波長為490 nm。

2.2.5 線性關(guān)系的考察 精密吸取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 m L共5份，分別置于10 mL量瓶中，加水補至2.0 mL，再加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入硫酸5.0 mL，80℃加熱15 min，取出，冷卻至室溫。另以2.0 mL蒸餾水同上平衡操作作為空白對照，490 nm波長處測定吸光度，得回歸方程:A=0.046 4 C+0.033 9，R2=0.999 1(n=5)，線性范圍2.5～12.5μg/mL。

2.2.6 精密度實驗 精密吸取對照品溶液0.4mL于10mL量瓶中，加水補至2.0 mL，按照2.2.5項下操作，重復(fù)測定6次，490 nm處測得吸光度值。經(jīng)計算，RSD為0.45%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 樣品中多糖的測定 精密吸取供試品溶液0.8 mL于10 mL量瓶中，按2.2.5項下操作，490 nm處測定吸光度，將測得的吸光度代入線性方程，求得質(zhì)量濃度C，按以下公式計算多糖量:

其中，D為稀釋倍數(shù)1 000，藥材量為69 g。

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗結(jié)果

3.1.1 超聲功率對多糖的影響 固定加水量12倍，提取溫度50℃，提取時間20 min，提取次數(shù)1次，考察不同功率 (200W、300 W、400 W、500 W)對多糖量的影響。

如圖1所示，隨著超聲功率的增加，提取得到的多糖量逐步增加。

圖1 超聲功率對多糖的影響

3.1.2 加水量對多糖的影響 固定超聲功率300 W，提取溫度50℃，提取時間20 min，提取次數(shù)1次，考察不同的加水量 (6倍，9倍，12倍，15倍，18倍)對多糖量的影響。如圖2所示，隨著加水量的增加，多糖量逐步增加，加水量為15倍時，多糖量最高，繼續(xù)增加加水量，多糖量反而下降。

圖2 加水量對多糖的影響

3.1.3 溫度對多糖的影響 固定超聲功率300 W，加水量12倍，提取時間20 min，提取次數(shù)1次，考察不同的溫度 (40℃，50℃，60℃，70℃，80℃)對多糖量的影響。見圖3所示，隨著提取溫度的增加，多糖量逐步增加。

圖3 提取溫度對多糖的影響

3.1.4 時間對多糖的影響 固定超聲功率300 W，加水量12倍，提取溫度50℃，提取次數(shù)1次，考察不同的提取時間 (10 min，20 min，30 min，40 min，50 min)對多糖量的影響。見圖4所示，隨著提取時間的增加，多糖量逐步增加，當(dāng)提取時間為30 min時，多糖量最高，繼續(xù)增加提取時間，多糖量下降。

圖4 提取時間對多糖量的影響

3.2 正交試驗結(jié)果 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定正交試驗因素水平，選用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗。因素水平表見表1，正交試驗結(jié)果見表2及表3。

表1 因素水平

表2 正交試驗結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

由極差分析可知，因素的主次順序為C＞B＞A，C(提取次數(shù))為主要影響因素，因素A(加水量)的影響較小;由方差分析可知，因素C具有顯著性差異。綜合極差分析和方差分析結(jié)果可知，超聲提取的最佳方案為A2B2C2，即15倍水提取2次，每次提取時間為30 min。

3.3 驗證性實驗 分別稱取藥材3份，按上述最佳方案進(jìn)行提取，并測定多糖量，實驗結(jié)果表明，由上述確定的最佳方案提取該復(fù)方多糖量較高，該方案較穩(wěn)定。結(jié)果見表4。

表4 驗證性實驗結(jié)果

4 討論

多糖是一類天然大分子化合物，具有多種生物活性，如抗腫瘤活性、抗菌活性、降血脂作用、調(diào)節(jié)免疫等［4-7］，因而受到國內(nèi)外許多學(xué)者的關(guān)注。多糖類物質(zhì)的提取方法較多，如熱水浸提法，酶提取法，超聲提取方法，微波輔助提取方法等［8-11］。其中，超聲提取方法是近年來常用于提取中草藥有效成分的新方法，其原理是利用超聲波的機械作用、熱學(xué)作用、空化作用等對植物細(xì)胞的破碎作用，加速植物有效成分的溶出、擴散，具有省時、節(jié)能、操作簡便、避免高溫對有效成分的破壞等優(yōu)點［12］。

山蘆桑顆粒劑是一種以多糖為主要有效部位的復(fù)方制劑，本實驗采用苯酚-硫酸法測定多糖量，通過單因素試驗及正交試驗優(yōu)選其超聲提取工藝。其中，單因素試驗以多糖量為考察指標(biāo)，分別考察了超聲功率、加水量、提取時間、提取溫度對多糖提取效果的影響，考慮到成本和時間，提取次數(shù)一般不超過3次，因此未對提取次數(shù)進(jìn)行單因素考察。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選用加水量、提取時間、提取次數(shù)為正交試驗因素水平，超聲功率為500 W，提取溫度為80℃，進(jìn)行正交試驗。對正交試驗結(jié)果進(jìn)行極差分析可知，因素主次順序為C＞B＞A，即提取次數(shù)＞提取時間＞加水量，提取次數(shù)對多糖量的影響最大，加水量的影響最小。由方差分析結(jié)果可知，因素C即提取次數(shù)具有顯著性差異，其余因素均無顯著性差異。為了節(jié)約濃縮時的成本，選擇A2，因此最佳提取方案為15倍水超聲提取2次，每次提取時間為30 min。

本實驗研究確定了該復(fù)方制劑超聲提取的提取方法和相關(guān)條件，為其制備成顆粒劑提供了基礎(chǔ);但采用超聲提取方法超聲提取方法破碎了植物的細(xì)胞，加速了多糖的溶出、擴散，故本提取方法提取出的雜質(zhì)也相應(yīng)增加，其中提取出的多糖經(jīng)過醇沉后仍含有少量單糖等雜質(zhì)，還有待進(jìn)一步純化。參考文獻(xiàn):

［1］胡斌杰，王 芳，王方林，等．超聲法提取香菇多糖最佳工藝優(yōu)化研究［J］．中成藥，2007，29(7):附4-附6．

［2］郝繼偉．超聲法提取蒙山松菇多糖的工藝研究［J］．食品工業(yè)科技，2011，32(1):213-218．

［3］張 璐，翁立冬，劉 莉，等．苯酚-硫酸法測定烏梅多糖的含量［J］．中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17(6):107-109．

［4］Zhang M，Cui SW，Cheung PCK，etal．Antitumor polysaccharides from mushrooms:a review on their isolation process，structural characterisics and antitumor activity［J］．Trends in Food Science＆ Technology，2007，18(1):4-19．

［5］Liu Nan，Chen Xiguang，Park Hyunjin，et al．Effect of MW and concentration of chitosan on antibacterial activity of Escherichia coli［J］．Carbohydr Polym，2006，64(1):60-65．

［6］楊小紅，周遠(yuǎn)明，張 瑜．白首烏多糖降血脂作用研究［J］．時珍國醫(yī)國藥，2010，21(6):1381-1382．

［7］董宏坡，江明樹，朱偉杰．化橘紅多糖對小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用［J］．中成藥，2010，32(3):491-493．

［8］楊 鑫，王鑫淼，高星燁，等．紅松松塔多糖提取工藝優(yōu)化及其含量測定［J］．中成藥，2011，33(2):351-353．

［9］王巖巖，陳東海，車烈權(quán)，等．纖維素酶提取枸杞多糖及工藝優(yōu)化［J］．食品科技，2007(3):104-106．

［10］葉余原．超聲法提取鐵皮石斛多糖工藝的研究［J］．中藥材，2009，32(4):617-620．

［11］覃逸明．微波法提取真姬菇多糖工藝研究［J］．中成藥，2009，31(7):1134-1136．

［12］鄔方寧．超聲提取技術(shù)在現(xiàn)代中藥中的應(yīng)用［J］．中草藥，2007，38(2):315-316．