比色法測(cè)定四味消扶散中總?cè)扑岷?/h1>
2013-09-14 07:07:38章紅燕周俐斐林能明蘆柏震
中國藥業(yè) 2013年5期
章紅燕，周俐斐，林能明，蘆柏震
(浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江 杭州 310022)
四味消扶散是根據(jù)我院臨床經(jīng)驗(yàn)方研制的抗腫瘤新藥，由白花蛇舌草、炒山楂等4味中藥組方，多年的臨床觀察表明，其對(duì)腫瘤患者手術(shù)、放射治療、化學(xué)治療期間的輔助治療和治療間歇、恢復(fù)期的固本治療方面，療效確切[1]。四味消扶散中含有的熊果酸、齊墩果酸等三萜酸具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡等作用[2－3]。筆者采用分光光度法測(cè)定了四味消扶散中總?cè)扑岬暮?，方法快速簡便，穩(wěn)定可靠。
1 儀器與試藥
Agilent 8453型紫外分光光度儀;QC－250型超聲波清洗器(上海超聲波儀器廠)。四味消扶散(本院制劑室自制，批號(hào)分別為20061201，20070301，20070605);熊果酸對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110742－200415);冰乙酸，香草醛，高氯酸均為分析純。
2 方法與結(jié)果
2.1 溶液制備
取四味消扶散1包(28 g)，加入95%乙醇溶液500 mL，水浴加熱回流提取2 h，放冷，濾紙減壓過濾，濾液置500 mL量瓶中，加95%乙醇定容至刻度，搖勻;從中取出0.5 mL至10 mL容量瓶中，加95%乙醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密稱取熊果酸對(duì)照品適量，用無水乙醇制成每1 mL含100 μg熊果酸的對(duì)照品溶液。
2.2 香草醛—高氯酸顯色條件
取供試品或?qū)φ掌啡芤?，水浴蒸干后，?%香草醛－冰醋酸0.4 mL，然后再加高氯酸1.0 mL溶解搖勻后，于60℃中加熱10 min，冰浴冷卻，加冰醋酸5.0 mL，搖勻即可。
2.3 波長選擇
取供試品溶液和對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下條件顯色反應(yīng)后，于400～700 nm波長間進(jìn)行掃描。結(jié)果供試品溶液與對(duì)照品溶液在544 nm處均有最大吸收峰，且空白對(duì)照無吸收，故選擇544 nm作為測(cè)定波長。
2.4 方法學(xué)考察
精密度試驗(yàn):取對(duì)照品溶液1 mL，按2.2項(xiàng)下條件顯色反應(yīng)后，于544 nm波長處測(cè)定吸光度6次，結(jié)果分別為0.616 68，0.618 29，0.617 13，0.616 17，0.615 34，0.614 77，RSD=0.21%(n=6)。
標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:分別取對(duì)照品溶液 0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50 mL，按 2.2 項(xiàng)下條件顯色反應(yīng)后，于 544 nm 波長處測(cè)定。以熊果酸對(duì)照品量(μg)為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸方程 Y=0.005 2 X+0.121 8，r=0.993 6(n=6)。結(jié)果表明，熊果酸進(jìn)樣量在25～125 μg范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。
重現(xiàn)性試驗(yàn):取四味消扶散(批號(hào)為200703011)3包，按2.1項(xiàng)下方法制備，取出0.5 mL按2.2項(xiàng)下條件顯色反應(yīng)，然后于544 nm 波長處測(cè)定吸光度，結(jié)果分別為 0.377 68，0.382 89，0.363 01，RSD=2.75% 。
穩(wěn)定性試驗(yàn):取重現(xiàn)性試驗(yàn)項(xiàng)下3份供試品溶液，分別于顯色后 0，5，10，15，20，30 min 測(cè)定吸光度。結(jié)果顯示，20 min 內(nèi)RSD=0.37%，供試品溶液穩(wěn)定。
加樣回收試驗(yàn):取已知含量的樣品，分別添加熊果酸對(duì)照品，按上述測(cè)定條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。
表1 熊果酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)
2.5 樣品含量測(cè)定
取3個(gè)不同批號(hào)的樣品各3包，按2.1項(xiàng)下方法制備，取出0.5 mL按2.2項(xiàng)條件顯色反應(yīng)，然后于544 nm波長處測(cè)定 A，計(jì)算含量。結(jié)果見表2。
表2 樣品中總?cè)扑岷繙y(cè)定結(jié)果
3 討論
香草醛－高氯酸比色法是測(cè)定中藥材及制劑中總?cè)扑岷枯^常用的方法，但影響因素較多。對(duì)試劑的用量、反應(yīng)時(shí)間等因素考察后，最終確定了文中的反應(yīng)條件。另外，冰醋酸、香草醛、高氯酸等試劑的含水量會(huì)使最大吸收波長發(fā)生位移，并對(duì)測(cè)定靈敏度產(chǎn)生影響。
總?cè)扑嵩谝掖?、甲醇等極性有機(jī)溶劑中有較好的溶解度。試驗(yàn)中比較了加熱回流提取1，2，3 h和超聲提取0.5 h的提取率，結(jié)果顯示四味消扶散加熱回流提取2 h與3 h總?cè)扑岬牡寐驶疽恢?，并顯著高于超聲提取0.5 h，說明加熱回流提取2 h即可提取完全。
樣品含量測(cè)定結(jié)果表明，總?cè)扑嵩谒奈断錾⒅械暮靠蛇_(dá)3%以上，可能是其抗腫瘤主要成分之一。
[1]Lu BZH，Ling NM，He XB，et al.Analysis of Hedyotic diffusa in our hospital for anti－ tumor therapy[J].China Journal of Chinese Materia Medica(中國中藥雜志)，2006，(18):1 550 －1 552.
[2]Chiang LC，Chiang W，Chang MY，et al.Antileukemic activity of selected natural products in Taiwan[J].American Journal of Chinese Medicine，2003，31(1):37 －46.
[3]Fernandes J，Castilho RO，da Costa MR，et al.Pentacyclic triterpenes from Chrysobalanaceae species:cytotoxicity on multidrug resistant and sensitive leukemia cell lines[J].Cancer Letters，2003，190(2):165 － 169.
章紅燕，周俐斐，林能明，蘆柏震
(浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江 杭州 310022)
四味消扶散是根據(jù)我院臨床經(jīng)驗(yàn)方研制的抗腫瘤新藥，由白花蛇舌草、炒山楂等4味中藥組方，多年的臨床觀察表明，其對(duì)腫瘤患者手術(shù)、放射治療、化學(xué)治療期間的輔助治療和治療間歇、恢復(fù)期的固本治療方面，療效確切[1]。四味消扶散中含有的熊果酸、齊墩果酸等三萜酸具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡等作用[2－3]。筆者采用分光光度法測(cè)定了四味消扶散中總?cè)扑岬暮?，方法快速簡便，穩(wěn)定可靠。
1 儀器與試藥
Agilent 8453型紫外分光光度儀;QC－250型超聲波清洗器(上海超聲波儀器廠)。四味消扶散(本院制劑室自制，批號(hào)分別為20061201，20070301，20070605);熊果酸對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110742－200415);冰乙酸，香草醛，高氯酸均為分析純。
2 方法與結(jié)果
2.1 溶液制備
取四味消扶散1包(28 g)，加入95%乙醇溶液500 mL，水浴加熱回流提取2 h，放冷，濾紙減壓過濾，濾液置500 mL量瓶中，加95%乙醇定容至刻度，搖勻;從中取出0.5 mL至10 mL容量瓶中，加95%乙醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密稱取熊果酸對(duì)照品適量，用無水乙醇制成每1 mL含100 μg熊果酸的對(duì)照品溶液。
2.2 香草醛—高氯酸顯色條件
取供試品或?qū)φ掌啡芤?，水浴蒸干后，?%香草醛－冰醋酸0.4 mL，然后再加高氯酸1.0 mL溶解搖勻后，于60℃中加熱10 min，冰浴冷卻，加冰醋酸5.0 mL，搖勻即可。
2.3 波長選擇
取供試品溶液和對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下條件顯色反應(yīng)后，于400～700 nm波長間進(jìn)行掃描。結(jié)果供試品溶液與對(duì)照品溶液在544 nm處均有最大吸收峰，且空白對(duì)照無吸收，故選擇544 nm作為測(cè)定波長。
2.4 方法學(xué)考察
精密度試驗(yàn):取對(duì)照品溶液1 mL，按2.2項(xiàng)下條件顯色反應(yīng)后，于544 nm波長處測(cè)定吸光度6次，結(jié)果分別為0.616 68，0.618 29，0.617 13，0.616 17，0.615 34，0.614 77，RSD=0.21%(n=6)。
標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:分別取對(duì)照品溶液 0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50 mL，按 2.2 項(xiàng)下條件顯色反應(yīng)后，于 544 nm 波長處測(cè)定。以熊果酸對(duì)照品量(μg)為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸方程 Y=0.005 2 X+0.121 8，r=0.993 6(n=6)。結(jié)果表明，熊果酸進(jìn)樣量在25～125 μg范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。
重現(xiàn)性試驗(yàn):取四味消扶散(批號(hào)為200703011)3包，按2.1項(xiàng)下方法制備，取出0.5 mL按2.2項(xiàng)下條件顯色反應(yīng)，然后于544 nm 波長處測(cè)定吸光度，結(jié)果分別為 0.377 68，0.382 89，0.363 01，RSD=2.75% 。
穩(wěn)定性試驗(yàn):取重現(xiàn)性試驗(yàn)項(xiàng)下3份供試品溶液，分別于顯色后 0，5，10，15，20，30 min 測(cè)定吸光度。結(jié)果顯示，20 min 內(nèi)RSD=0.37%，供試品溶液穩(wěn)定。
加樣回收試驗(yàn):取已知含量的樣品，分別添加熊果酸對(duì)照品，按上述測(cè)定條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。
表1 熊果酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)
2.5 樣品含量測(cè)定
取3個(gè)不同批號(hào)的樣品各3包，按2.1項(xiàng)下方法制備，取出0.5 mL按2.2項(xiàng)條件顯色反應(yīng)，然后于544 nm波長處測(cè)定 A，計(jì)算含量。結(jié)果見表2。
表2 樣品中總?cè)扑岷繙y(cè)定結(jié)果
3 討論
香草醛－高氯酸比色法是測(cè)定中藥材及制劑中總?cè)扑岷枯^常用的方法，但影響因素較多。對(duì)試劑的用量、反應(yīng)時(shí)間等因素考察后，最終確定了文中的反應(yīng)條件。另外，冰醋酸、香草醛、高氯酸等試劑的含水量會(huì)使最大吸收波長發(fā)生位移，并對(duì)測(cè)定靈敏度產(chǎn)生影響。
總?cè)扑嵩谝掖?、甲醇等極性有機(jī)溶劑中有較好的溶解度。試驗(yàn)中比較了加熱回流提取1，2，3 h和超聲提取0.5 h的提取率，結(jié)果顯示四味消扶散加熱回流提取2 h與3 h總?cè)扑岬牡寐驶疽恢?，并顯著高于超聲提取0.5 h，說明加熱回流提取2 h即可提取完全。
樣品含量測(cè)定結(jié)果表明，總?cè)扑嵩谒奈断錾⒅械暮靠蛇_(dá)3%以上，可能是其抗腫瘤主要成分之一。
[1]Lu BZH，Ling NM，He XB，et al.Analysis of Hedyotic diffusa in our hospital for anti－ tumor therapy[J].China Journal of Chinese Materia Medica(中國中藥雜志)，2006，(18):1 550 －1 552.
[2]Chiang LC，Chiang W，Chang MY，et al.Antileukemic activity of selected natural products in Taiwan[J].American Journal of Chinese Medicine，2003，31(1):37 －46.
[3]Fernandes J，Castilho RO，da Costa MR，et al.Pentacyclic triterpenes from Chrysobalanaceae species:cytotoxicity on multidrug resistant and sensitive leukemia cell lines[J].Cancer Letters，2003，190(2):165 － 169.
