孟彥波

(邢臺醫(yī)學高等?？茖W校，河北 邢臺 054000)

恩曲他濱(emtricitabine，ETC)是一種合成的5位氟取代胞嘧啶硫雜脫氧核苷類似物，在體內被細胞酶磷酸化為恩曲他濱－5'－三磷酸酯，不僅可與脫氧胞苷－5'－三磷酸酯競爭抑制HIV－1反轉錄酶的活性，還能嵌入到新生病毒DNA序列中，導致DNA鏈的終止[1]，臨床主要用于艾滋病和慢性乙型肝炎的治療[2－3]。目前，ETC與DNA作用的研究尚未見文獻報道。本研究中以pH=7.4的三羥甲基胺基甲烷－鹽酸(Tris－HCl)為緩沖溶液，利用紫外分光光度法和熒光光譜法研究其與小牛胸腺DNA(ct－DNA)之間的作用模式和作用機制，測定了結合常數、結合位點數、猝滅常數等相關數據，為從分子水平了解DNA與小分子的相互作用機制提供了有用的信息和依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TU－1901型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);LS50B型熒光分光光度計(美國PerkinElmer公司);pHS－2C型pH計(上海雷磁儀器廠);501型超級恒溫器(上海市實驗儀器廠);BP211D型1/10萬電子分析天平(美國Sartorius公司);KQ－100A超聲波清洗器(唐山市超聲儀器有限公司)。恩曲他濱由河北醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程中心提供;小牛胸腺DNA購自博勵陽(北京)生物醫(yī)學技術發(fā)展有限公司(Sigma公司產品)，純度以 A260nm/A280nm＞1.8衡量，濃度由260 nm的吸光度確定[ε260nm=6 600 L/(mol·cm)]，為 2.38 ×10－4mol/L，4 ℃保存?zhèn)溆肹4];溴化乙錠(EB)配制成 2.53×10－4mol/L的儲備溶液，避光保存，使用時稀釋成所需濃度;Tris－HCl緩沖溶液(0.05 mol/L，pH=7.4)、NaCl和 NaH2PO4等均為分析純;試驗用水均為二次石英亞沸蒸餾水。

1.2 方法

吸收光譜:于10 mL離心管中加入2.0 mL Tris－HCl緩沖溶液、一定量的DNA－EB溶液和ETC溶液并稀釋至刻度，搖勻后掃描一定波長范圍內的吸收光譜。

熒光光譜:取所需濃度的DNA－EB體系3 mL于石英比色皿中，滴加ETC溶液，混合均勻2～3 min后，測定其熒光光譜。由于每次加入的溶液量遠遠小于原溶液的量，故可忽略其體積效應，認為原溶液的濃度保持不變。

2 結果與分析

2.1 紫外吸收光譜

在ct－DNA和EB體系中，加入不同量的ETC溶液的吸收光譜見圖1。ETC對DNA－EB的吸收光譜在285 nm波長處產生了較明顯的增色效應，但峰位移動不明顯;此外，在308 nm波長處產生等吸點，初步判斷ETC與DNA之間存在著嵌插作用[5]。

2.2 熒光光譜

固定EB－DNA的濃度不變，加入不同濃度ETC后掃描熒光光譜，見圖2。在595 nm波長處，隨著ETC濃度的增加，EB－DNA的熒光強度逐漸降低，進一步說明ETC與DNA發(fā)生了相互作用，使得ETC對EB－DNA的熒光產生了淬滅效應。

2.3 熒光淬滅方式的判斷

熒光淬滅機理可分為靜態(tài)淬滅和動態(tài)淬滅[6]。靜態(tài)淬滅是淬滅劑和熒光物質分子在基態(tài)時生成不發(fā)光的配合物，導致熒光物質熒光強度降低的過程，此過程可用下式描述:F0/F=1+Kq[C](公式1)。動態(tài)淬滅是淬滅劑和熒光分子的激發(fā)態(tài)分子之間的相互碰撞而導致的熒光淬滅，遵循Stern－volmer方程:F0/F=1+Kqτ0[C]=1+Ksv[C](公式2)。公式 1和 2中 F0和 F分別為不存在和存在淬滅體時熒光體的熒光強度;Kq為雙分子淬滅過程的速率常數;Ksv為Stern－volmer動態(tài)淬滅常數;τ0為淬滅劑不存在時熒光分子的熒光平均壽命，[C]為淬滅劑的濃度，而熒光分子壽命約為10－8s[7]，由圖4中直線的斜率可求得淬滅速率常數 Kq=7.8×1010L/(mol·s)。顯然 DNA對 ETC的淬滅常數大于藥物小分子與生物大分子之間的最大擴散所控制的碰撞淬滅常數 2.0×1010L/(mol·s)[7]，因此DNA對ETC的熒光淬滅不是由于分子間碰撞而引起動態(tài)淬滅的，而是形成了復合物引起的靜態(tài)淬滅。

對于靜態(tài)淬滅過程，熒光強度與淬滅劑的關系可由熒光分子與淬滅劑分子之間的結合常數表達式推導求出[8]。設生物大分子Q與熒光分子 P有 n個相同且獨立的結合位點，則應該存在:nP+Q?PnQ(公式3)。于是反應常數 K應為:K=[PnQ]/[P]n[Q](公式 4)。

公式4中，[P]是游離熒光體濃度，[Q]是淬滅劑濃度，[PnQ]是復合物濃度，熒光強度 F與熒光分子P的濃度成正比，則有:[P0]/[P]=F0/F(公式5)。由公式4和5式可以得到:lg[(F0－ F)/F]=lgK+nlg[Q](公式 6)。

固定熒光分子P的濃度[P0]，改變淬滅劑的濃度[Q]，根據公式6以lg[(F0－F)/F]對lg[Q]作圖可得一直線，由該直線的斜率和截距可求結合位點 n和結合常數 K。

由圖4所得的直線截距可以計算出ETC與DNA的結合常數為 K=1.02×103L/mol，由直線斜率得出結合位點 n=1.03。

2.4 ETC與DNA結合反應的熱力學性質及作用力

藥物小分子與生物大分子的作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等，不同藥物與生物大分子作用時其作用力類型也可能不同。當溫度變化不大時，反應的焓變可視作常數，根據熱力學公式可以計算藥物小分子與生物大分子作用的有關熱力學參數:ln(K2/K1)=ΔH(1/T1－1/T2)/R(公式 7)，ΔG=－ RTlnK(公式8)，ΔS=(ΔH－ΔG)/T(公式9)。

根據藥物小分子與生物大分子作用的有關熱力學參數可以簡單判斷其相互作用類型[9]，若ΔH＞0及ΔS＞0則主要表現(xiàn)為疏水作用;ΔH＜0及ΔS＞0主要表現(xiàn)為靜電作用;ΔH＜0及ΔS＜0主要表現(xiàn)為氫鍵或者范德華力作用。

由圖5可見，隨著溫度的升高，ETC淬滅曲線的斜率隨之降低，由此可判斷該過程是靜態(tài)淬滅而不是動態(tài)淬滅。動態(tài)淬滅是由于分子的擴散碰撞導致的，隨著溫度的升高，分子的擴散速度會加快，熒光淬滅會更加嚴重，淬滅常數應更大，這與2.3項下的結論一致。根據試驗得到不同溫度下的 K值，可以求出ETC與DNA結合反應的熱力學參數為，ΔH=－85.9 kJ/mol，ΔG(300 K)=－17.1 kJ/mol，ΔS(300K)= －0.30 kJ/mol，由此判斷 LMVD 與DNA之間是以氫鍵或者范得華力作用結合的。

3 討論

采用紫外分光光譜法、熒光光譜法，用EB作為熒光探針研究了ETC與DNA的相互作用。結果表明，ETC與DNA分子之間的作用模式為嵌插結合，作用力為氫鍵或范德華力，ETC與DNA的結合位點數為 1.03，結合常數為 1.02 × 103L/mol。

[1]Nelson M，Schiavone M.Emtricitabine(FTC)for the treatment of HIV infection[J].Int J Clin Pract，2004，58(5):504 － 510.

[2]張須媚.抗HIV/AIDS藥恩曲他濱(emtricitabine)[J].世界臨床藥物，2004，25(11):700 －704.

[3]潘鈺卿.慢性乙型肝炎治療進展[J].世界臨床藥物，2004，25(11):668－673.

[4]Pyle AM，Rehmann JP，Meshoyrer CV，et al.Mixed － ligand complexes of ruthenium:factors governing binding to DNA[J].J A m Chem Soc，1989，111:3 051－ 3 053.

[5]Long EC，Barton JK.On demonstration DNA intercalation[J].Accounts Chem Res，1990，23:273 － 277.

[6]嚴 琳，嚴拯宇，邵秀芬，等.左氧氟沙星與牛血清白蛋白相互作用的研究[J].中國藥科大學學報，2004，35(5):456 －459.

[7]張海容，郭祀遠，李 琳，等.熒光法研究司帕沙星與白蛋白的作用[J].光譜學與光譜分析，2001，21(6):829 －832.

[8]魏曉芳，劉會洲.TritonX2100與牛血清白蛋白的相互作用[J].分析化學，2000，28(6):699 －701.

[9]Ross DP，Sabramanian S.Thermodynamics of protein association reactions:forcescontr－ ibutingtostability[J].BioChemistry，1981，20:3096 －3102.