賁 瑩，張鳳華，梁文杰，張 冬，方 倩

實驗性自身免疫性神經炎(experimental autoimmune neuritis，EAN)是一種由T細胞介導的炎性脫髓鞘性周圍神經系統(tǒng)的自身免疫性疾病，與格林－巴利綜合征(Guillain-Barre syndrome，GBS)的臨床表現和免疫學特點相似。GBS的病因治療主要為免疫球蛋白靜脈滴注和血漿置換，費用昂貴，且治療后仍有約25%的患者有肢體無力等后遺癥。丙戊酸是由8個碳原子和脂肪酸支鏈組成的簡單化合物，臨床用于抗驚厥和癲癇治療。近年來研究發(fā)現，丙戊酸能拮抗多種損傷因素誘導的神經細胞凋亡，還能減少腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)產生，抑制核轉錄因子-κB(NF-κB)激活，發(fā)揮抗炎作用，對抗炎癥誘導的神經細胞損傷［1］。本研究應用丙戊酸鈉治療EAN大鼠，觀察治療效果，分析治療作用機制，為臨床治療GBS提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物與材料 Lewis雄性大鼠36只，鼠齡8～10周，體重170～200 g，清潔級，購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心。注射用丙戊酸鈉購自Sigma公司。周圍神經髓鞘抗原(P257-81)多肽購自上海吉爾生化有限公司;ED1抗活化的巨噬細胞抗體、CD3抗T淋巴細胞抗體購自Serotec公司;IL-17抗體、Foxp3染色緩沖組合購自eBioscience公司?？俁NA提取試劑(Trizol)、逆轉錄試劑盒購自大連寶生物有限公司，引物參照Gene Bank序列，應用Primer Express 5.0軟件合成，由大連寶生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 分組:將實驗大鼠隨機分為治療組、模型組和正常組各12只。

1.2.2 模型建立:模型組及治療組大鼠雙后肢足底注射 200 μl抗原乳劑［將 100 μl完全弗氏佐劑(CFA)和含 P257-81(100 μg)的 0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)100 μl用針式勻漿器混勻成油包水乳劑］。免疫當天記為第0天。治療組于免疫0～15 d每天固定時段于大鼠腹腔注射300 mg/kg丙戊酸鈉(用1 ml PBS溶解稀釋)，模型組、正常組在同時點注射等量的PBS。

1.2.3 觀察指標

1.2.3.1 發(fā)病情況評估:免疫后每天對大鼠進行神經系統(tǒng)體征評分［2］:0分:無異常;1分:尾部張力降低;2分:尾癱，翻正反射部分缺失;3分:翻正反射缺失;4分:步態(tài)失調、姿態(tài)異常;5分:后肢輕癱;6分:中度癱瘓;7分:后肢嚴重癱瘓;8分:四肢癱瘓;9分:瀕死;10分:死亡。

1.2.3.2 坐骨神經病理及免疫組化改變:于免疫第16天斷頭處死大鼠，取部分坐骨神經根置于10%甲醛溶液中固定24 h，流水沖洗1 h，制成石蠟塊，切片行HE染色，光鏡下觀察病理改變。

用免疫組化法對T細胞、巨噬細胞浸潤的情況進行檢測。常規(guī)脫蠟、滅活內源酶、微波修復抗原、滴加10%標準豬血清封片。加一抗:CD3抗T淋巴細胞(1∶50)，ED1抗活化的巨噬細胞(1∶100)，于4℃孵育過夜。加二抗室溫孵育，滴加S-A/HRP，37℃孵育20 min，PBS 沖洗，DAB 顯色，蘇木素輕度復染、封片、觀察。應用Image-Pro Plus系統(tǒng)(×400)采集圖像，進行陽性細胞面積分析，結果用陽性細胞面積占坐骨神經橫切面面積的百分比表示。

1.2.3.3 外周血中Th17、Foxp3+Treg細胞檢測:采集大鼠外周血100 μl，加入紅細胞裂解液，用含0.5%皂甙的緩沖洗液透化處理10 min。在室溫下用兔抗鼠IL-17抗體(1∶100)進行細胞孵育1 h。應用緩沖洗劑清洗2次，于暗室內用FITC-標記的羊抗兔Ig-F(ab)2片段(1∶100)進行孵育1 h，而后進行流式細胞檢測。

采集大鼠外周血100 μl，加紅細胞裂解液，振蕩混勻后靜置10 min，離心，去上清，加PBS洗2遍，取100 μl放入流式管。加入 CD4-FITC、CD25-APC，預冷的PBS洗滌細胞，重懸細胞后加入破膜工作液混勻，避光4℃孵育30 min，加入Permeabilization Buffer工作液離心洗滌細胞，棄上清液。加入稀釋血清，避光孵育15 min，加入熒光標記Fox3抗體，避光孵育40 min，加入Permeabilization Buffer洗滌細胞去上清。用Flow Cytometry Staining Buffer重懸細胞，上機檢測。

1.2.3.4 大鼠淋巴結中細胞因子的變化:用Trizol法從大鼠腹股溝淋巴結中提取RNA，－70℃保存。用逆轉錄聚合式酶聯(lián)反應(RT-PCR)技術檢測TNF-α、γ 干擾素(IFN-γ)、IL-17、β 型轉化生長因子(TGF-β)的mRNA表達水平。引物序列:

取RT-PCR產物5 μl經2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)成像，半定量分析用Quantityone軟件測定各電泳條帶光密度值，按公式:mRNA相對光密度值=目的條帶光密度值/甘油醛-3磷酸脫氫酶(GAPDH)的光密度值，將表達量化。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，比較采用t檢驗，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 發(fā)病情況 治療組發(fā)病時間較模型組顯著延遲，疾病高峰期(免疫后第15天)神經系統(tǒng)體征評分明顯低于EAN模型組(P＜0.05)，見表1。

表1 大鼠實驗性自身免疫性神經炎模型組和治療組發(fā)病時間及神經系統(tǒng)體征評分(±s)

表1 大鼠實驗性自身免疫性神經炎模型組和治療組發(fā)病時間及神經系統(tǒng)體征評分(±s)

注:治療組為于免疫0～15 d每天固定時段腹腔注射300 mg/kg丙戊酸鈉(用1 ml PBS溶解稀釋)，模型組為免疫后同時點注射等量PBS;aP＜0.05

組別 只數 發(fā)病時間(d)神經系統(tǒng)體征評分(分)治療組 12 12.02 ±1.64a 2.63 ±1.09a 12 9.11 ±1.16 6.58 ±1.70模型組

2.2 坐骨神經的髓鞘脫失和炎性細胞浸潤情況治療組坐骨神經血管周圍髓鞘脫失及炎性細胞浸潤情況較模型組顯著減輕(圖1)。模型組坐骨神經有大量T細胞和巨噬細胞浸潤，其中以巨噬細胞為多，治療組細胞浸潤較模型組明顯減少(P＜0.05)(圖2、3，表 2)。

圖1 大鼠實驗性自身免疫性神經炎模型組和治療組坐骨神經切片病理結果(HE×400) A.模型組;B.治療組

圖2 大鼠實驗性自身免疫性神經炎模型組和治療組坐骨神經切片CD3免疫組化染色結果(HE×400)

圖3 大鼠實驗性自身免疫性神經炎模型組和治療組坐骨神經切片ED1免疫組化染色結果(HE×400)

表2 大鼠實驗性自身免疫性神經炎模型組和治療組坐骨神經切片T細胞、巨噬細胞陽性面積(±s，%)

表2 大鼠實驗性自身免疫性神經炎模型組和治療組坐骨神經切片T細胞、巨噬細胞陽性面積(±s，%)

注:治療組為于免疫0～15 d每天固定時段腹腔注射300 mg/kg丙戊酸鈉(用1 ml PBS溶解稀釋)，模型組為免疫后同時點注射等量PBS;aP＜0.05

組別 只數 T 細胞 巨噬細胞治療組 12 0.24 ±0.10a 1.67 ±1.16a 12 0.58 ±0.14 6.15 ±1.49模型組

2.3 外周血中Th17、Foxp3+Treg細胞檢測情況模型組與治療組外周血中Th17、Foxp3+Treg細胞所占百分比均顯著高于正常組(P＜0.05);治療組外周血中Th17細胞所占百分比顯著低于模型組，Foxp3+Treg細胞所占百分比顯著高于模型組(P＜0.05)，見表3。

表3 3組外周血中Th17和Foxp3+Treg細胞所占比例(±s，%)

表3 3組外周血中Th17和Foxp3+Treg細胞所占比例(±s，%)

注:治療組為于免疫0～15 d每天固定時段腹腔注射300 mg/kg丙戊酸鈉(用1 ml PBS溶解稀釋)，模型組和正常組均同時點注射等量PBS;與正常組比較，aP＜0.05;與模型組比較，cP ＜0.05

組別 只數 Th17細胞 Foxp3+Treg 細胞治療組 12 1.85 ±0.46ac 15.09 ±1.34ac 12 1.18 ±0.26 5.03 ±0.94模型組 12 3.67 ±0.38a 6.26 ±0.75a正常組

2.4 淋巴結中細胞因子表達情況 模型組與治療組淋巴結中 TNF-α、IFN-γ、IL-17 和 TGF-β 的 mRNA表達水平均較高于正常組(P＜0.05);治療組大鼠淋巴結中TNF-α、IFN-γ和IL-17的mRNA表達水平低于模型組，TGF-β的mRNA表達水平高于模型組(P ＜0.05)，見表4。

表4 3組淋巴結中細胞因子mRNA表達情況(±s，%)

表4 3組淋巴結中細胞因子mRNA表達情況(±s，%)

注:治療組為于免疫后0～15 d每天固定時段腹腔注射300 mg/kg丙戊酸鈉(用1 ml PBS溶解稀釋)，模型組和正常組均同時點注射等量PBS;TNF-α為腫瘤壞死因子α，IFN-γ為γ干擾素，IL-17為白介素17，TGF-β為β型轉化生長因子;與正常組比較，aP ＜0.05;與模型組比較，cP ＜0.05

組別 只數 TNF-α IFN-γ IL-17 TGF-β治療組 12 0.38 ±0.02ac0.45 ±0.08ac0.63 ±0.17ac0.74 ±0.15ac 12 0.17 ±0.05 0.23 ±0.04 0.36 ±0.09 0.28 ±0.13模型組 12 0.63 ±0.04a 0.75 ±0.03a 1.29 ±0.11a 0.62 ±0.16a正常組

3 討論

GBS是由于非特異性感染所引起的自身免疫性多發(fā)性周圍神經病。在病理方面，活化的輔助性T細胞可識別抗原呈遞細胞上的周圍神經自身抗原，對EAN的啟動起著重要作用［3］?；罨木奘杉毎ㄟ^直接的吞噬攻擊和分泌炎性介質引發(fā)髓鞘脫失，清除巨噬細胞并抑制其活性可抑制EAN的發(fā)展［4］。本研究結果顯示，丙戊酸減少了周圍神經系統(tǒng)中T細胞、巨噬細胞的浸潤，因此，該藥能夠使局部炎癥減輕，髓鞘脫失減少，使EAN病情得到改善。

細胞因子對炎癥和免疫有重要的調節(jié)作用。IFN-γ、TNF-α能夠激活巨噬細胞，增加血－神經屏障的通透性。其中，IFN-γ能誘導血旺細胞、巨噬細胞主要組織相容性復合物Ⅱ類抗原(MHC-Ⅱ)表達，TNF-α能上調iNOS特異性mRNA在施萬細胞表達，促進釋放 NO。IL-17能誘導 TNF、IL-6、黏附分子1(ICAM-1)、NO和前列腺素E2的產生，促進T細胞激活，引起組織損傷［5-6］。TNF-α、IFN-γ、IL-17這些促炎細胞因子在EAN中起著啟動和促進作用［7］。TGF-β具有抑制抗原呈遞細胞及拮抗效應性T細胞的功能，并可誘導初始CD4+T細胞轉化為Foxp3+Treg 細胞，從而抑制免疫應答［8］。TGF-β 在EAN中起著控制炎性反應、促進組織修復的作用［9］。免疫應答時細胞因子譜系的產生決定著免疫應答的結局。本研究結果顯示，丙戊酸能減少TNF-α、IFN-γ、IL-17 mRNA 的表達，增加 TGF-β mRNA的表達，從而使EAN的自身免疫應答減輕。

Th17和Foxp3+Treg細胞同屬于CD4+T細胞。Th17 細胞通過分泌 IL-17、IL-22、IL-6、TNF-α、集落刺激因子等促炎細胞因子參與自身免疫，在誘導自身免疫的組織損害及炎癥過程中起著決定性的作用。Th17細胞能促進多種自身免疫性疾病發(fā)生，如多發(fā)性硬化、類風濕性關節(jié)炎、狼瘡、哮喘等［5］。Foxp3+Treg細胞能夠直接抑制T細胞，并可分泌TGF-β抑制免疫系統(tǒng)的激活，并因此預防了過度的炎性反應和(或)自身免疫，從而致免疫耐受和免疫穩(wěn)態(tài)［10］。Foxp3+Treg細胞能夠減弱自身免疫疾病實驗動物模型中(包括自身免疫性腦脊髓炎、糖尿病、胃炎、狼瘡、前列腺炎和甲狀腺炎等)的免疫應答［11］。Th17和Foxp3+Treg細胞兩者相互拮抗，從而維持機體免疫狀態(tài)相對穩(wěn)定。本研究結果顯示，丙戊酸可使 EAN大鼠外周血中Th17細胞減少，Foxp3+Treg細胞增加，以減輕病情。

丙戊酸是臨床治療雙重精神障礙和癲癇的常用藥物。近年來發(fā)現其作為組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor，HDACi)可抑制 HDAC活性，通過改變組蛋白乙?；竭_到染色質結構重塑，從根本上調節(jié)基因表達［12］。目前的研究表明，HDACi在多種動物模型中具有抗炎作用，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎等［13］。HDACi能增加激活的Foxp3+Treg細胞的數量［14］，調節(jié) T細胞分化，有效地減少促炎細胞因子如 IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-12、IL-6、IL-17 和 IL-17F 的表達［13］。因此，丙戊酸可能通過對HDAC的抑制效應減輕EAN的癥狀。

［1］Onofrj M，Thomas A，Paci C.Reversible parkinsonism induced by prolonged treatment with valproate［J］.J Neurol，1998，245(12):794-796.

［2］Cavaletti G，Mata S，Fasano A，et al.Lipid-free versus lipid-bound P2 protein-induced experimental allergic neuritis:clinicopathological，neurophysiological，and immunological study［J］.J Neurosci Res，2000，62(5):709-716.

［3］Schabet M，Whitaker J N，Schott K，et al.The use of protease inhibitors in experimental allergic neuritis［J］.J Neuroimmunol，1991，31(3):265-272.

［4］Maurer M，Toyka K V，Gold R.Cellular immunity in inflammatory autoimmune neuropathies［J］.Rev Neurol(Paris)，2002，158(12 Pt 2):S7-S15.

［5］Bettelli E，Korn T，Oukka M，et al.Induction and effector functions of T(H)17 cells［J］.Nature，2008，453(7198):1051-1057.

［6］Dong C.TH17 cells in development:an updated view of their molecular identity and genetic programming［J］.Nat Rev Immunol，2008，8(5):337-348.

［7］Zhu J，Mix E，Link H.Cytokine production and the pathogenesis of experimental autoimmune neuritis and Guillain-Barre syndrome［J］.J Neuroimmunol，1998，84(1):40-52.

［8］Nakamura K，Kitani A，Fuss I，et al.TGF-beta 1 plays an important role in the mechanism of CD4+CD25+regulatory T cell activity in both humans and mice［J］.J Immunol，2004，172(2):834-842.

［9］Creange A，Belec L，Clair B，et al.Circulating transforming growth factor beta 1(TGF-beta1)in Guillain-Barre syndrome:decreased concentrations in the early course and increase with motor function［J］.J Neurol Neurosurg Psychiatry，1998，64(2):162-165.

［10］Tang Q，Bluestone J A.The Foxp3+regulatory T cell:a jack of all trades，master of regulation［J］.Nat Immunol，2008，9(3):239-244.

［11］O＇Connor R A，Anderton S M.Multi-faceted control of autoaggression:Foxp3+regulatory T cells in murine models of organ-specific autoimmune disease［J］.Cell Immunol，2008，251(1):8-18.

［12］Phiel C J，Zhang F，Huang E Y，et al.Histone deacetylase is a direct target of valproic acid，a potent anticonvulsant，mood stabilizer，and teratogen［J］.J Biol Chem，2001，276(39):36734-36741.

［13］Wang L，de Zoeten E F，Greene M I.Immunomodulatory effects of deacetylase inhibitors:therapeutic targeting of Foxp 3+regulatory T cells［J］.Nat Rev Drug Discov，2009，8(12):969-981.

［14］Leoni F，Fossati G，Lewis E C.The histone deacetylase inhibitor ITF2357 reduces production of pro-inflammatory cytokines in vitro and systemic inflammation in vivo［J］.Mol Med，2005，11(1-12):1-15.