蔡劉體 汪漢成 劉艷霞 曹毅 袁賽飛 趙準(zhǔn)備 石俊雄

青枯菌（Ralstonia solanacearum）是一種土傳性的細(xì)菌性病原菌，屬于革蘭氏陰性細(xì)菌，廣泛分布于熱帶、亞熱帶及一些溫帶地區(qū)，它具有廣泛的寄主，可以侵染 50多個(gè)科的 200多種植物［1］，包括煙草（Nicotiana tabacum）、芝麻（Sesamum indicum）、花生（Arachishypogaea）、大豆（Glycinemax）、蘿卜（Raph-anus sativus）等多種農(nóng)作物以及一些貴重藥材和花卉植物，嚴(yán)重危害一些農(nóng)作物的產(chǎn)量，其中馬鈴薯、番茄、煙草等茄科作物受害最為嚴(yán)重［2］。

青枯菌是一個(gè)復(fù)雜的菌種［3］，寄主范圍寬、分布廣泛，具有高度的變異性和適應(yīng)性，不同地域或不同寄主的菌株間有明顯的變異和分化現(xiàn)象［3，4］，而且青枯菌生理生化致病途徑眾多［5］。為了探索青枯菌引起的病害、青枯病害的流行規(guī)律，更好地指導(dǎo)青枯病害的防控及經(jīng)濟(jì)作物的抗病育種，國(guó)內(nèi)外研究者開(kāi)展了青枯菌內(nèi)亞分類(lèi)或菌系分群的研 究 工 作。 前 人 從 生 理 小 種（races）［5］、 生 化型（biovars）［6］、 血 清 型（serotypes）［7］、 溶 源 型（lysotypes）［8］、脂肪酸型［9-11］、基因型（genetypes）［12］、種系型［3］等多方面對(duì)種內(nèi)分型進(jìn)行研究，目前大多數(shù)認(rèn)同的分型方法主要有生理小種、生化型和種系型（phylotypes）3種分型方法。本文綜述青枯菌種內(nèi)分型的主要研究進(jìn)展，并對(duì)不同的分型進(jìn)行比較，期望為煙草青枯菌系的構(gòu)成和遺傳多樣性分析，以及煙草與青枯菌互作研究提供參考。

1 青枯菌種內(nèi)分型方法

1.1 生理小種

青枯菌具有廣泛的寄主，按照不同來(lái)源的青枯菌株系對(duì)不同植物種類(lèi)的致病性差異，早在20世紀(jì)60、70年代，Buddenhagen等［13-17］制定了青枯菌生理小種的劃分方法，把青枯菌劃分為5個(gè)生理小種［18］：（1）生理小種 1（race1）：可侵染茄科植物和其他科植物的青枯菌；（2）生理小種2（race2）：只侵染香蕉（Musa paradisiaca）、大蕉（Musa sapientum L.）和Heliconia的青枯菌；（3）生理小種3（race3）：只侵染馬鈴薯，偶爾侵染番茄和茄子的青枯菌；（4）生理小種4（race4）：只對(duì)姜（Zingiber officinale）有很強(qiáng)致病力的青枯菌；（5）生理小種5（race5）：特異性侵染桑屬植物的青枯菌。按照寄主把青枯菌分為不同的生理小種對(duì)作物抗病育種非常有用，而且目前青枯菌生理小種的劃分仍然延用該方法，但是由于青枯菌寄主范圍廣泛，按照寄主劃分的方法工作量大，較耗費(fèi)時(shí)間［19］，而且有同一青枯菌株系同時(shí)被劃歸到幾個(gè)生理小種的情況出現(xiàn)。

1.2 生化型

青枯菌的另一個(gè)亞分類(lèi)系統(tǒng)主要是由Hayward等［20，21］提出的，他們根據(jù)青枯菌對(duì)3種雙糖（麥芽糖、乳糖和纖維二糖）和3種己醇（甘露醇、山梨醇和半乳糖醇）氧化產(chǎn)酸能力的差異，將從各大洲收集的185個(gè)青枯菌分為4個(gè)生化型：生化型1（不能氧化3種雙糖和3種己醇）、生化型2（只能氧化3種雙糖，不能氧化3種己醇）、生化型3（能氧化3種雙糖和3種己醇）、生化型4（只能氧化3種己醇，不能氧化3種雙糖）。Hayward等［22］在此基礎(chǔ)上，依據(jù)青枯菌利用硝酸鹽還原反應(yīng)和利用硝酸鹽產(chǎn)生氣體情況，將青枯菌劃分為6個(gè)生化型。表1顯示按照對(duì)糖、醇以及硝酸鹽的利用情況，將青枯菌劃分為5個(gè)生化型，但根據(jù)其對(duì)海藻糖、肌糖、D-核糖以及果膠酶的利用情況，把生化型2分為生化型2A和生化型2T/2N（表2），其中生化型2A包括有RFLP分型的 26組和27組。青枯菌株系生化型的研究報(bào)道目前仍沿用［23］，鄒陽(yáng)等［24］采用該方法分析了中國(guó)重慶地區(qū)煙草青枯菌的生化型。該方法分析青枯菌的生化型相對(duì)而言，工作量較小且較短時(shí)間獲得結(jié)果，但是也有出現(xiàn)個(gè)別青枯菌株系不好劃分的情況［25］。

1.3 種系型（或稱(chēng)為演化型）

隨著分子生物學(xué)和分子進(jìn)化技術(shù)的發(fā)展，青枯菌研究者在青枯菌生理小種和生化型劃分的基礎(chǔ)上，期望了解青枯菌的種系結(jié)構(gòu)、遺傳背景、地理起源及其與復(fù)雜群體的相關(guān)性，F(xiàn)egan和Prior［3］共同提出了以親緣關(guān)系為基礎(chǔ)的劃分體系，將青枯菌分成4個(gè)種系型，每一個(gè)種系型又繼續(xù)分成更小的群體，稱(chēng)為序列型（sequevars）。在此劃分框架中，種系型定義為菌株的16S-23S rRNA 基因間間隔區(qū)（ITS），hrp（超敏反應(yīng)蛋白基因）和egl（內(nèi)切葡聚糖酶基因）的序列數(shù)據(jù)，通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析顯示為一個(gè)單系群。按照這種劃分，每個(gè)種系型反應(yīng)了菌株的地理起源，其中種系型Ⅰ和Ⅱ分別由亞洲和美國(guó)菌株組成，種系型Ⅲ的成員由非洲菌株組成，種系型Ⅳ包括來(lái)自印度尼西亞和澳大利亞的 R.syzygii和 BDB［3，18］。青枯菌種系型是根據(jù)青枯菌特異性引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增的帶型特征來(lái)劃分，青枯菌種系型的劃分方法見(jiàn)表3，一個(gè)青枯菌株系的種系型可以基于IST區(qū)間序列信息設(shè)計(jì)引物的基礎(chǔ)上，通過(guò)復(fù)合PCR快速的鑒定出來(lái)［3］。徐進(jìn)等［26］采用復(fù)合PCR檢測(cè)青枯菌種系型的分析方法，分析了福建主要煙區(qū)的45個(gè)煙草青枯菌株系都屬于種系型I；潘哲超等［27］基于內(nèi)切葡萄糖酶基因系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的分析，結(jié)果表明來(lái)自福建和部分貴州的62個(gè)煙草青枯菌株系均歸屬于青枯菌亞洲分支（種系型I）。

表1 青枯菌不同生化型的劃分［20］

表2 青枯菌生化型II的亞型劃分

表3 基于ITS區(qū)設(shè)計(jì)的用于青枯菌種系型分析的特異性條帶PCR擴(kuò)增的引物信息［3，18］

2 青枯菌分型的比較

與生理小種和生化型劃分相比較，種系型的劃分框架似乎能更準(zhǔn)確的反映出目前已知青枯菌的遺傳多樣性和復(fù)雜性。在生理小種劃分框架中，生理小種1（R1）定義為“可侵染茄科植物和其他科植物”的青枯菌株系包含非常寬泛，從種系型看，可以歸為R1的包含有種系型I-種系型IV的青枯菌株系；而生理小種2（R2）和生理小種3（R3）的寄主范圍很窄，在生理小種劃分框架中所反映的遺傳多樣性也比較窄，R2和R3在種系型框架中都是屬于種系型II。在生化型劃分框架中，生化型1和2T青枯菌株系包含有4個(gè)種系型中的3個(gè)，而且在青枯菌株系劃分中，僅僅知道其是生化型1和2T也不能提供該株系的更多信息。

種系型劃分框架，首先基于對(duì)菌株的16S-23S rRNA 基因間間隔區(qū)（ITS），hrp和egl基因的序列數(shù)據(jù)分析，通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析定義單系群，然后從基因序列水平上來(lái)反應(yīng)每個(gè)種系型與菌株的地理起源和遺傳信息的對(duì)應(yīng)關(guān)系，分為4個(gè)種系型。劃分框架中每個(gè)種系型中都可以細(xì)分為序列型，使其成為開(kāi)放性的劃分框架，有利于對(duì)新發(fā)現(xiàn)的青枯菌株系進(jìn)行劃分，也有利于其自身信息和劃分框架的完善。然而，無(wú)論是生理小種、生化型還是種系型的劃分框架，都不能直接反映出青枯菌株系的致病性和致病力，許多研究表明采用的種下分型的分析方法與青枯菌的致病性無(wú)特定的相關(guān)性［28］。

3 小結(jié)

青枯菌這個(gè)復(fù)雜種至少包含有4個(gè)遺傳群體或種系型，反映出其遺傳多樣性和地理起源信息。人們通過(guò)各種方法把青枯菌分型是為了作物育種工作者、植物病理學(xué)者和植物保護(hù)人員能更好地了解青枯菌的寄主、分布、遺傳及致病力等信息，減少或控制農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)損失。隨著收集的青枯菌資源不斷豐富，可能會(huì)有越來(lái)越多的青枯菌株系劃分到各個(gè)種系型中，序列型數(shù)目會(huì)越來(lái)越豐富。收集和分類(lèi)青枯菌資源非常重要，但更重要的是了解青枯菌株系的生態(tài)、進(jìn)化、遺傳及致病力等特性，這些信息對(duì)于控制青枯病危害的研究尤其重要。近年來(lái)，已經(jīng)報(bào)道完成了青枯菌多個(gè)株系的全基因組的測(cè)序［29-34］，這些青枯菌全基因組測(cè)序信息的解析和積累，青枯菌致病基因家族信息分析及青枯菌致病途徑的闡述，將有助于青枯菌種內(nèi)分型的推進(jìn)，及青枯菌與宿主相互作用的研究和青枯病的防控研究。

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