羊宋貞 馮廣達 姚青 王永紅 姚雨欣 朱紅惠

隨著生活水平的提高，冰箱已成為家庭生活中必不可少的電器之一，在保鮮和預防食物變質等方面起到了重要作用。冰箱中的食物也常被認為是“最干凈”的，在廣州市先烈中路小學學生中的調查發(fā)現(xiàn)：65％的學生認為冰箱是家庭中最為干凈的場所，他們有著直接食用冰箱中的水果、飲料等食物的習慣。而事實上，冰箱低溫的環(huán)境僅能降低部分微生物的生長速度，并不能創(chuàng)造無菌的環(huán)境。儲存于冰箱中的食物會隨時間的推移而變質［1］。人們也常因食用冰箱里的食物而感染病菌。家庭冰箱中的微生物主要由哪些種類構成，以及是否存在致病菌等問題目前未見報道。針對該問題，本研究隨機選取了5個單位同事的家庭冰箱進行了微生物的分離培養(yǎng)，通過PCR和DNA測序對其種類進行了初步鑒定，以期了解家庭冰箱中的微生物，為冰箱的科學合理使用提供建議。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器 牛肉膏（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）、蛋白胨（英國Oxoid公司）、Easy-TaqTMDNA聚合酶（北京全式金生物技術有限公司）、dNTP（廣州東盛生物科技有限公司）、瓊脂糖（美國Amresco公司）；PCR儀（德國耶拿公司）、電泳儀（北京市六一儀器廠）、高速離心機（美國Sigma公司）。

1.1.2 材料 隨機選取了Li、Lu、Wang、Yang和Zhu等5個同事的家庭冰箱為研究對象，對每個家庭冰箱中不同位置的微生物取樣調查。

1.1.3 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基成分：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，瓊脂 15g，H2O 1L；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基成分：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，H2O 1L；高氏1號培養(yǎng)基成分：可溶性淀 粉 20g，KNO31g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCl0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g， 瓊 脂 15g，H2O 1L。

1.2 方法

1.2.1 分離方法 采用滅菌棉簽擦拭冰箱的冷藏室和冰箱門內壁，后放入滅菌試管中，帶回實驗室分析。此外，將預先配制好的營養(yǎng)瓊脂（NA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）和高氏1號培養(yǎng)基平板放入冰箱冷藏室中的不同位置，打開蓋子，過夜放置，收集冰箱中懸浮的微生物，后30℃倒置培養(yǎng)7d。擦拭冰箱內壁的棉簽采用無菌水洗滌，以10倍梯度逐級稀釋，分別取100μL不同稀釋梯度的菌液涂布于營養(yǎng)瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂和高氏1號培養(yǎng)基平板上，30℃倒置培養(yǎng)7d。隨機挑取培養(yǎng)基上不同形態(tài)的菌株進行純化，制備菌株的甘油種，保存于-80℃冰箱。

1.2.2 微生物鑒定 細菌菌株采用16S rRNA基因PCR擴增測序，引物為27F和1492R［2］。DNA提取采用煮沸法［3］，取2mL菌液于離心管中，12000r/min離心，棄上清，收集菌體，后加入無菌雙蒸水200μL，渦旋均勻。95℃水浴5min，12000r/min離心1min，以2μL上清液作為模板。對于少數(shù)PCR擴增失敗的菌株，則棄去煮沸的上清液，采用CTAB法［4］進行DNA提取。真菌DNA亦采用CTAB法提取。酵母菌采用26S rRNA基因PCR擴增測序，引物為NL1和NL4［5］，霉菌則采用ITS測序，引物為ITS1和ITS4［5］（表 1）。25μL PCR 擴增體系包括：1×Buffer，dNTP 200μmol/L，引物各0.2μmol/L，EasyTaq酶 1.25 U。細菌的PCR擴增程序為：95℃ 3min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1.5min，30 個循環(huán) ；72℃ 20min，目的片段約為1.5 kb。真菌的PCR擴增程序：95℃3min ；94℃ 30s，53℃（26S rRNA）或 55℃（ITS）30s，72℃ 40s，30 個循環(huán) ；72℃ 20min。26S rRNA基因和ITS目的片段分別約為680bp和700bp。PCR產物采用加入Gold View的1％瓊脂糖凝膠電泳檢驗，由英濰捷基（上海）貿易有限公司測序。將獲得的所有菌株的測序結果在http：//www.ncbi.nlm.nih.Gov/網(wǎng)站進行BLAST，獲得與之同源性最高的已知菌株。冰箱中分布廣泛的真菌還采用掃描電鏡觀察其形態(tài)，方法參見文獻［6］。

表1 用于細菌和真菌鑒定的通用引物

2 結果

2.1 家庭冰箱中的細菌分布情況

從5個家庭冰箱中分離到細菌84株，16S rRNA基因序列分析發(fā)現(xiàn)，它們涵蓋了28個屬，22個科，10個目，6個綱，4個門。在屬水平上的分布情況如表2所示，家庭冰箱中的細菌主要以芽孢桿菌（Bacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、庫克氏菌（Kocuria）和假單胞菌（Pseudomonas）4個屬的菌株為主，分別占分離總菌數(shù)的16.67％、13.10％、11.90％和7.14％。其次為類芽孢桿菌（Paenibacillus）、微桿菌（Microbacterium）、短波單胞菌（Brevundimonas）、短桿菌（Brevibacterium）、短狀桿菌（Brachybacterium）和玫瑰單胞菌（Roseomonas）等6個屬，均分別占分離總菌數(shù)的3.57％。其他屬的菌株均不足2％，包括了Acinetobacter、Carnobacterium、Cellulosimicrobium、Chruseobacterium、Curtobacterium、Enterococcus、Exiguobacterium、Janibacter、Leucobacter、Lysinibacillus、Massilia、Nocardiopsis、Oceanobacillus、Rahnella、Streptomyces、Arthrobacter、Micrococcus、Stenotrophomonas等18個屬。

5個家庭冰箱中有4個均分離到了Bacillus屬的菌株，主要為解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefacien）、蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）、巨大芽孢桿菌（B.megaterium）和產硫芽孢桿菌（B.thioparans）。Staphylococcus屬的菌株在4個家庭冰箱中也均有分布，主要以溶血性葡萄球菌（S.haemolyticus）和人葡萄球菌（S.hominis）為主。Kocuria屬的菌株也分布在4個家庭冰箱中，以沼澤考克氏菌（K.palustris）和嗜根考克氏菌（K.rhizophila）為主。Pseudomonas屬的菌株在3個家庭冰箱中得到分離，主要以稻皮假單胞菌（P.oryzihabitans）為主。其余24個屬的菌株僅零星分布于1-2個家庭冰箱中。家庭冰箱中的細菌在門水平上的分布情況如圖1所示，主要以硬壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）為主，分別占分離總菌數(shù)的41.67％和36.90％。其次為變形菌門（Proteobacteria），占 20.23％（α-protebacteria、β-protebacteria和γ-protebacteria 3個綱分別占7.14％、1.19％和11.9％）。擬桿菌門（Bacteroidetes）僅占分離總菌數(shù)的1.19％。

表2 家庭冰箱中分離的細菌數(shù)量

圖1 家庭冰箱中的細菌在門水平上的分布

84株細菌中有14株為致病菌，占16.67％。它們主要以Staphylococcus屬的菌株為主，除溶血性葡萄球菌（S.haemolyticus）和人葡萄球菌（S.hominis）外，還包括了阿爾萊特葡萄球菌（S.arlettae）、山羊葡萄球菌（S.caprae）、上皮葡萄球菌（S.epidermidis）、科氏葡萄球菌（S.cohnii）、松鼠葡萄球菌（S.sciuri）、雞葡萄球菌（S.gallinarum）和腐生葡萄球菌（S.saprophyticus），廣泛分布于4個家庭的冰箱中。此外，冰箱中的致病菌還包括了藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）和鶉雞腸球菌（Enterococcus gallinarum）。這些菌株均為致病菌或條件致病菌，感染對象為人或動物，表明家庭冰箱中存在著致病風險。

2.2 家庭冰箱中的真菌分布情況

表3 家庭冰箱中分離的真菌數(shù)量

圖2 家庭冰箱中部分真菌的掃描電鏡圖

從5個家庭冰箱中分離到真菌74株，26S rRNA基因或ITS序列分析發(fā)現(xiàn)，它們涵蓋了23個屬，17個科，16個目，11個綱，3個門。在屬水平上的分布情況如表3所示，家庭冰箱中的真菌主要以枝孢菌（Cladosporium）、曲霉（Aspergillus）和青霉（Penicillium）3個屬的霉菌為主，分別占真菌總數(shù)的31.08％、20.27％和12.16％，代表菌株的掃描電鏡觀察結果如圖2所示。其余屬的菌株所占比例均分別不足3％，包括了Aureobasidium、Candida、Chaetomium、Cochliobolus、Cryptococcus、Emericella、Eurotium、Eutypella、Fusarium、Hanseniaspora、Hortaea、Lacazia、Meyerozyma、Phlebia、Pichia、Pleurotus、Pseudozyma、Rhizomucor、Rhodotorula、Toxicocladosporium等20個屬。Cladosporium屬的菌株主要由球孢枝孢（C.sphaerospermum）或枝狀枝孢（C.cladosporioides）組成，在5個家庭的家庭冰箱中均有分布。Aspergillus屬的菌株主要以雜色曲霉（A.versicolor）和聚多曲霉（A.sydowii）為主，在5個家庭冰箱中也均有分布。Penicillium屬以草酸青霉（P.oxalicum）為主，分布在4個家庭冰箱中。其他屬的菌株僅零星分布于1-2個家庭冰箱中。家庭冰箱中的真菌在門水平上的分布如圖3所示，主要以子囊菌門（Ascomycota）為主，約占分離總菌數(shù)的89.19％，其次是擔子菌門（Basidiomycota），占總菌數(shù)的9.46％。未知菌門（Unknown）最少，僅占1.35％。

分離得到的74株真菌中有4株為致病菌，約占5.4％，包括了黑色毛殼菌（Chaetomium nigricolor）、威尼克何德霉（Hortaea werneckii）、Lacazia loboi和Pseudozyma aphidis。這些致病菌零星分布于3個家庭冰箱中。與細菌相比，真菌中的致病菌數(shù)量相對較少，分布較為隨機。

圖3 家庭冰箱中的真菌在門水平上的分布

3 討論

冰箱作為家庭生活的必備電器之一，在我國具有很高的普及率。隨著生活節(jié)奏的加快，人們越來越習慣于將大量的食物儲存其中，他們認為冰箱中的食物是最“安全”的，也常直接生食儲存其中的水果、蔬菜等食物。事實上，冰箱的低溫環(huán)境并不能殺死由空氣、食物或其他儲藏物品帶入到冰箱中的微生物，只能延緩部分微生物的生長速度，人們食用后依然會引發(fā)疾病。周宇光等［7］就從家庭冰箱存放的蔬菜等食物中分離到了34株產生不良氣味的冷育細菌。家庭冰箱里的微生物主要由哪些種類組成？是否存在潛在的致病風險？了解這些問題有助于人們在日常生活中科學合理地使用冰箱和養(yǎng)成良好的飲食習慣。為此，本研究對隨機選取的5個家用冰箱中的細菌和真菌進行了分離培養(yǎng)和鑒定。研究結果表明，家庭冰箱中的細菌以Bacillus、Staphylococcus、Kocuria和 Pseudomonas屬的菌株為主，其他屬的菌株零星分布于不同家庭冰箱中。祝白春等［8］、辛克銘等［9］的研究均發(fā)現(xiàn)飲食業(yè)冰箱中存在著嚴重的霉菌污染，但未對霉菌的種類進行詳細的研究。本研究也取得了類似的結果，發(fā)現(xiàn)家庭冰箱中的真菌主要是以Cladosporium、Aspergillus和Penicillium屬的霉菌為主，其他屬的菌株僅零星分布于不同的冰箱中。通過本研究可以發(fā)現(xiàn)，家庭冰箱中生活著種類豐富的微生物，長期低溫的環(huán)境并不像常人想象的那樣能消滅微生物。

本研究從家庭冰箱中分離得到微生物158株，其中致病菌18株，約占11.39％。致病菌中有14株為細菌，構成了家庭冰箱中的主要致病菌。它們大部分為Staphylococcus屬的菌株，在4個家庭冰箱中均得到分離，這些菌株對人或動物具有致病性，且大部分的宿主為人。真菌致病菌相對較少，且分布較為分散。家庭冰箱中的這些致病菌可能引起的疾病較為廣泛，不僅僅局限于消化系統(tǒng)的疾病，而是能夠引起呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、皮膚、肌肉等病變，如多種類型的皮癬、膀胱炎、敗血癥等。Dugleux等［10］對11個患敗血癥病人病因研究發(fā)現(xiàn)，致病原是儲存在冰箱中的腸胃營養(yǎng)添加劑中出現(xiàn)了陰溝腸桿菌的污染。由此可見，家庭冰箱中存在較高的致病風險，對人體的潛在威脅不容小覷。家庭冰箱中儲存的物品較為復雜，包括生鮮的瓜果蔬菜、魚肉蛋奶等，這些食品的來源也極為復雜，涉及的場所有農田土壤、菜市場、家禽家畜養(yǎng)殖場、水產養(yǎng)殖場、屠宰場等，使得家庭冰箱中微生物的群落構成也極為復雜，從而增加了冰箱的致病風險。因此，人們在使用冰箱過程中應注意定期對其進行清洗和消毒，以保持清潔的環(huán)境，減少致病菌的數(shù)量［11］，目前市場上專門針對冰箱的消毒產品仍有待研發(fā)。

4 結論

本研究結果表明，家庭冰箱中生活著種類豐富的微生物。其中，細菌主要以芽孢桿菌（Bacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、庫克氏菌（Kocuria）和假單胞菌（Pseudomonas）屬的菌株為主，廣泛分布于家庭冰箱中。真菌則以枝孢菌（Cladosporium）、曲霉（Aspergillus）和青霉（Penicillium）屬的霉菌為主。家庭冰箱中的致病菌主要為葡萄球菌屬（Staphylococcus）的菌株，包括了溶血性葡萄球菌（S.haemolyticus）、人葡萄球菌（S.hominis）、上皮葡萄球菌（S.epidermidis）等，這些菌株對人或動物具有致病性，家庭冰箱存在潛在的致病風險。因此，冰箱的安全問題應引起足夠的重視，人們在食用冰箱儲存的食物時應先認真清洗其表面，或用開水浸泡滅菌，盡量避免直接生食。此外，還應加強對冰箱的定期清潔和消毒，以保障飲食的安全。

［1］ 王躍河, 肖建軍.微生物對冰箱冷藏食品的影響研究.家電科技 , 2006（9）：45-48.

［2］ Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, et al.16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.Journal of Bacteriology, 1991,173（2）：697-703.

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［6］ 東秀珠, 蔡妙瑛.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京：科學出版社, 2001：362-363.

［7］ 周宇光, 崔存起, 李鐘慶.嗜冷微生物和冷育微生物的研究Ⅳ.冰箱中產生怪味的冷育微生物.微生物學通報, 1989（2）：79-82.

［8］ 祝白春, 王解盾, 邢曉慧.南京市餐飲冰箱微生物污染調查.江蘇預防醫(yī)學, 1997（1）：69-70.

［9］ 辛克銘, 朱荔芳.飲食業(yè)家用冰箱貯存熟肉制品的微生物變化 .食品科學, 1993（8）：55-57.

［10］ Dugleux G, Coutour XL, Hecquard C, et al.Septicemia caused by contaminated parenteral nutrition pouches：the refrigerator as an unusual cause.Journal of Parenteral ＆ Enteral Nutrition, 1991, 15（4）：474-475.

［11］ 于曉波, 姜梅, 韓峰.醫(yī)院冰箱微生物監(jiān)測與消毒方法.中華醫(yī)院感染學雜志, 2008, 18（5）：733.