張曉梅 李新生 許正宏

3-羥基丙酸（3-hydroxypropionic acid，簡稱3-HP），又名β-羥基丙酸，是一種較為活潑的分子，可以用來合成多種重要的化工產(chǎn)品，還可以用于生產(chǎn)醫(yī)藥產(chǎn)品以及個人護理用品，所以其在商業(yè)上具有重大的開發(fā)價值［1］。目前，3-HP的生產(chǎn)方法主要是化學合成法，然而采用化學合成法生產(chǎn)3-HP難度較大，且產(chǎn)品分離純化較復雜，生產(chǎn)成本相應(yīng)較高。微生物發(fā)酵法與化學法相比，具有成本低、操作簡單、條件溫和、副產(chǎn)物少及綠色環(huán)保等優(yōu)點。利用自然篩選的微生物還無法直接進行發(fā)酵法生產(chǎn)3-HP。因此，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)菌株被認為是今后的研究方向［2］。

微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)3-HP有兩條途徑：以大腸桿菌為宿主菌，以葡萄糖［3-5］和甘油［6，7］為底物的生物轉(zhuǎn)化路線。Cameron在專利中首次報道了甘油能在甘油脫水酶（來源于克雷伯氏菌）的作用下生成3-羥基丙醛（3-HPA），后者在醛脫氫酶（來源于釀酒酵母）的繼續(xù)作用下生成3-HP［3-5］，但是，由于修飾系統(tǒng)的及啟動子原因，來自于釀酒酵母的Aldh活性在大腸桿菌中始終較低。Raj等［6］以E.coli BL21（DE3）為宿主共表達了來源于克雷白氏肺炎桿菌（K.pneumoniae）DSM2026的甘油脫水酶DhaB和來源于E.coli K-12 MG1655的乙醛脫氫酶AldH，該重組菌可以直接利用甘油生產(chǎn)3-HP，但其產(chǎn)量僅為0.58g/L，進一步優(yōu)化載體及誘導條件后，3-HP的最高產(chǎn)量達到4.4g/L［7］。最近有研究者報道了以K.pneumoniae 作為宿主菌，以甘油作為底物構(gòu)建了產(chǎn)3-HP 基因工程菌，但由于K.pneumoniae 將更多的甘油轉(zhuǎn)化成為1，3-丙二醇，因此3-HP的轉(zhuǎn)化率難以提高［8，9］。本研究室在前期構(gòu)建了能轉(zhuǎn)化甘油為3-HP的含有雙質(zhì)粒的重組大腸桿菌JM109（pUCtacaldh，pEtac-dhaB），其 3-HP 的產(chǎn)量為 4.9g/L［10］。由于雙質(zhì)粒存在穩(wěn)定性的問題，因此在前期研究基礎(chǔ)上構(gòu)建了在一個質(zhì)粒上串聯(lián)表達兩個關(guān)鍵酶基因的重組質(zhì)粒pEtac-dhaB-aldh，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli JM109，得到了含有單一質(zhì)粒、可以利用甘油產(chǎn)3-HP的重組菌E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh），應(yīng)用響應(yīng)面分析法對影響重組菌E.coli JM109（pEtac-dhaB-adlh）發(fā)酵的各因素最佳水平范圍及其交互作用進行探討，旨為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)3-HP奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌（Escherichia coli）JM109，由本實驗室保藏，質(zhì)粒載體pUCtac-aldh，pEtac-dhaB由本實驗室先期構(gòu)建和保藏［11，12］。

1.1.2 工具酶和試劑 限制性內(nèi)切酶Xba I、Pst I，堿性磷酸酶CIAP購自TaKaRa 公司；T4 DNA連接酶及Taq DNA聚合酶購自上海華美生物工程公司；Gel Extraction Mini Kit、PCR Purification Mini Kit 購自上海華舜生物工程有限公司。丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、廣范圍蛋白質(zhì)分子量標準為Promega公司產(chǎn)品。

1.1.3 SDS-PAGE 采用5％濃縮膠及12％分離膠的不連續(xù)垂直平板電泳，考馬斯亮藍R-250染色。以大腸桿菌JM109作對照。

1.1.4 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉10，固體培養(yǎng)基含20g/L的瓊脂，固體和液體培養(yǎng)基在需要時加入卡那霉素。種子培養(yǎng)基：采用LB培養(yǎng)基。

發(fā) 酵 培 養(yǎng) 基（g/L）：（NH4）2SO42.0，MgSO4·7H2O0.2，F(xiàn)eSO4·7H2O0.005，CaCl20.1，2mol/L KOH調(diào)pH值7.0。維生素B12、甘油、酵母膏及KH2PO4根據(jù)試驗方案設(shè)計。發(fā)酵：從新鮮的LB培養(yǎng)基斜面上挑取一環(huán)菌株接入50mL 搖瓶（裝液量為10mL）中，于旋轉(zhuǎn)式搖床中30℃、140r/min培養(yǎng)16h 得到種子液。按5％接種量接入500mL搖瓶（裝液量50mL）中，在140r/min旋轉(zhuǎn)式搖床中，培養(yǎng)至OD600為0.7，再加入1mmol/L IPTG誘導過夜，同時以未加入IPTG誘導的發(fā)酵液為對照。發(fā)酵條件優(yōu)化試驗根據(jù)試驗方案改變培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行發(fā)酵。

1.2 方法

1.2.1 重組菌E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh）質(zhì)粒穩(wěn)定性分析 單細胞生物的細胞呈幾何級數(shù)2n增長，當n=20時，220=1.05×106，將穩(wěn)定期的菌液稀釋10-6，再將其培養(yǎng)到穩(wěn)定期，即可認為細胞已連續(xù)傳代20次。具體方法如下：從新鮮轉(zhuǎn)化平板上挑取單菌落。接種至2mL不含抗生素的LB中，30℃培養(yǎng)24h，即得20代的菌液，以此類推，直至連續(xù)傳代至100代。其中每隔20代統(tǒng)計1次質(zhì)粒丟失情況，將上述菌液涂布于不含抗生素的LB板上，從中挑選100個單菌落分別點在添加和不添加抗生素的平板上，通過計數(shù)即可測得該代數(shù)的質(zhì)粒穩(wěn)定性。

1.2.2 測定方法 生物量用比色法檢測（OD600）光密度法檢測。發(fā)酵液中3-HP含量的檢測方法：采用高效液相色譜法，其最佳HPLC條件：色譜柱Diamonsal C18（5μm，250mm×4.6mm）；流動相 ：甲醇∶水=5∶95，加入H3PO4至0.05％；洗脫條件為：流動相平衡60min，洗脫時間20min，流速為0.8mL/min；檢測器：紫外檢測器。柱溫：30℃。

甘油的檢測方法：采用高效液相色譜法檢測。其最佳HPLC條件：色譜柱：ZORBAX NH2（5μm，250mm×4.6mm）；流動相：乙腈和水的配比為70：30；流動相平衡60min，洗脫時間20min，流速為1mL/min；檢測器：示差檢測器。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析

用含卡那青霉素50μg/mL篩選得到重組大腸桿菌E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh），重組大腸桿菌E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh）在無卡那霉素選擇壓力的條件下，連續(xù)轉(zhuǎn)種5次，統(tǒng)計重組大腸桿菌E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh）的菌落數(shù)。結(jié)果（表1）顯示，傳100代后重組大腸桿菌E.coli JM109（pEtacdhaB-aldh）的質(zhì)粒保持率為82％。

表1 重組菌E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh）連續(xù)轉(zhuǎn)種后在平板上的菌落數(shù)

2.2 重組菌全細胞蛋白SDS-PAGE電泳分析

挑取E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh）接種于含有卡那霉素50μg/mL的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至對數(shù)后期，1mmol/L IPTG誘導培養(yǎng)5h，離心收集菌體，超聲波破壁，加入1倍的SDS-PAGE電泳加樣緩沖液中懸浮，100℃水浴5min，進樣量為10μL，重組菌E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh）全細胞蛋白SDS-PAGE電泳分析如圖1所示。從圖1可以看出，其中61、21和16kD處出現(xiàn)蛋白質(zhì)特征帶正好對應(yīng)甘油脫水酶DHAB三個亞基分子量的位置，說明已經(jīng)存在表達產(chǎn)物。另外在54、49和12kD處出現(xiàn)蛋白質(zhì)特征帶正好與乙醛脫氫酶酶ALDH蛋白大小相符，說明表達產(chǎn)物中已經(jīng)存在乙醛脫氫酶酶蛋白。

2.3 重組菌的生長曲線

分別接種單菌落重組菌E.coli JM109（pEtacdhaB-aldh）于100mL LB培養(yǎng)基（含卡那霉素50μg/mL），37℃，120r/min培養(yǎng) 36h，每隔 2h取一次樣，重組菌的生長曲線如圖2。根據(jù)重組菌的生長曲線的結(jié)果，確定將重組菌E.coli JM109（pEtacdhaB-aldh）的種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基的接種時間確定為16h。

圖1 重組菌表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析

圖2 重組菌E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh）生長曲線

2.4 單因素試驗結(jié)果

2.4.1 初始甘油濃度對重組菌發(fā)酵的影響 考察重組菌發(fā)酵甘油產(chǎn)3-HP的能力，對該重組菌在不同初始甘油濃度 20、30、40、50、60、70 以及 80g/L（其中酵母膏6g/L、KH2PO47.5g/L、VB120.02g/L）的發(fā)酵培養(yǎng)基中37℃，140r/min，發(fā)酵48h，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，當甘油濃度在50g/L時，3-HP的產(chǎn)量最高可以達到3.4g/L。

2.4.2 維生素B12濃度對重組菌發(fā)酵的影響 發(fā)酵培養(yǎng)基中初始甘油濃度為50g/L時，考察了VB12的濃度對發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖4。從圖4可以看出，當VB12的濃度0.05g/L時，培養(yǎng)條件為37℃，140r/min培養(yǎng)48h，發(fā)酵液中3-HP產(chǎn)量3.8g/L。

圖3 甘油濃度對重組菌發(fā)酵產(chǎn)3-HP的影響

圖4 VB12濃度對重組菌發(fā)酵產(chǎn)3-HP的影響

2.4.3 磷酸二氫鉀濃度對重組菌發(fā)酵的影響 在初始甘油50g/L，VB12的濃度0.05g/L時，培養(yǎng)條件為37℃，140r/min培養(yǎng)48h，考察了KH2PO4濃度對產(chǎn)3-HP重組菌發(fā)酵結(jié)果的影響（圖5）。由圖5可知，當KH2PO4濃度為6g/L時，3-HP產(chǎn)量可達4.1g/L。2.4.4 酵母膏濃度對重組菌發(fā)酵的影響 發(fā)酵培養(yǎng)基中初始甘油濃度為50g/L，VB12的濃度為0.05g/L，KH2PO4濃度為6g/L時，培養(yǎng)條件為37℃，140r/min培養(yǎng)48h，考察了酵母膏濃度對重組菌發(fā)酵產(chǎn)3-HP的影響。由圖6可看出，當酵母膏濃度為5g/L時，3-HP的產(chǎn)量達到4.5g/L。但是隨著酵母膏濃度的增大，3-HP的產(chǎn)量逐漸下降，分析原因可能是由于酵母膏濃度增大導致菌體生長和其他代謝產(chǎn)物的形成。因此，合適的酵母膏濃度對于維持重組菌3-HP的較高產(chǎn)量水平也是至關(guān)重要的。

圖5 KH2PO4濃度對重組菌發(fā)酵產(chǎn)3-HP的影響

圖6 酵母膏濃度對重組菌發(fā)酵產(chǎn)3-HP的影響

2.5 響應(yīng)面分析（RSA）試驗設(shè)計

單因素發(fā)酵結(jié)果表明3-HP的含量主要取決于底物甘油的濃度，甘油脫水酶輔酶VB12的濃度，KH2PO4及氮源酵母膏的濃度，進一步采用響應(yīng)面分析的方法考察4個因素間的交互影響，進而提高3-HP的產(chǎn)量。將甘油濃度，甘油脫水酶輔酶VB12濃度，KH2PO4及酵母膏的濃分別記為變量X1、X2、X3、X4，以3-HP（g/L）作為響應(yīng)值，記為變量Y。根據(jù)Box-Behnken 的中心組成設(shè)計原理，設(shè)計了4因素3水平的響應(yīng)面分析（RSA）試驗，共有27個試驗點，依據(jù)單因素試驗結(jié)果選取試驗因素與水平，見表2；利用統(tǒng)計分析軟件Stat-Ease/Design-Expert6.12 對試驗結(jié)果進行分析。

通過二次回歸的旋轉(zhuǎn)中心結(jié)合設(shè)計，對這4個顯著因素進行尋優(yōu)，以3-HP的產(chǎn)量為響應(yīng)值，對應(yīng)于因變量Y 。運行SAS 軟件得到試驗設(shè)計表及試驗結(jié)果如表3 所示。

表2 因素與水平取值表

表3 響應(yīng)面設(shè)計表及試驗結(jié)果

SAS 分析所得到的擬合全變量二次回歸方程各變量的偏回歸系數(shù)估計值及方差分析結(jié)果見表4及表5。

當顯著性檢驗P＜0.05時，經(jīng)SAS分析X1，X3，X4，，X2X3，的P值均小于0.05（表5中帶有*標記），因此全變量二次回歸方程為：

Y=4.91+1.215* X1+0.26* X3+0.181*X4 -2.2*-0.71*-0.388 X2X3-0.425-0.510*。

表4 方差分析表

變量系數(shù)（CV）= 10.4929；R2=0.9839

表5 回歸方程偏回歸系數(shù)的估計值

對全變量的二次回歸模型進行規(guī)范分析，考察所擬合的相應(yīng)曲面形狀。獲得的響應(yīng)面立體圖如圖7-圖12 所示。

圖7顯示了KH2PO4及酵母膏位于中心水平，即6g/L和5g/L時，甘油與VB12對重組菌產(chǎn)3-HP性能的等高線圖及響應(yīng)面圖。從圖7可以看出，當維持VB12的濃度在一定范圍內(nèi)，3-HP的產(chǎn)量隨著甘油濃度的升高而增加，但到一定水平時，3-HP的產(chǎn)量隨著甘油濃度的升高反而下降，當甘油濃度在0.2-0.6（58-74g/L），VB12在 -0.6-0.6（0.02-0.07g/L）范圍內(nèi)，3-HP的產(chǎn)量大于4g/L。

圖8顯示了甘油與KH2PO4對重組菌產(chǎn)3-HP性能的交互影響效應(yīng)，等高線的形狀能反映出交互效應(yīng)的強弱的大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形與之相反。從圖中可以看出，當KH2PO4在一定范圍內(nèi)，3-HP的產(chǎn)量隨著甘油濃度的升高而增加，當甘油濃度在0.2-0.6（58-74g/L），KH2PO4在-0.6-0.9（4.2-8.7g/L）范圍內(nèi)，3-HP的產(chǎn)量大于4.8g/L。

圖8 甘油與KH2PO4對重組菌產(chǎn)3-HP影響的等高線圖及響應(yīng)面圖

圖9顯示了甘油與酵母膏對重組菌產(chǎn)3-HP性能的交互影響效應(yīng)，從圖中可以看出，當酵母膏在一定范圍內(nèi)，3-HP的產(chǎn)量隨著甘油濃度的升高而增加，當甘油濃度在0.2-0.6（58-74g/L），酵母膏在-0.6-0.8（2.6-8.2g/L）范圍內(nèi)，3-HP的產(chǎn)量大于4.4g/L。

圖10顯示了VB12與KH2PO4對重組菌產(chǎn)3-HP性能的交互影響效應(yīng)，從圖10的等高線圖可以直觀地看出兩因素的交互作用較為顯著，同樣從表5對回歸方程的顯著性檢驗得到VB12與KH2PO4交互作用顯著（P=0.0097＜0.05）。從圖10還可以看出，當KH2PO4在一定范圍內(nèi)，3-HP的產(chǎn)量隨著VB12的升高而增加，維持發(fā)酵培養(yǎng)基中足夠高的VB12濃度，對于保證3-HP產(chǎn)量是必需的。當VB12濃度在-0.6-0.5（0.02-0.075g/L），KH2PO4在 -0.4-0.9（4.8-8.7g/L）范圍內(nèi)，3-HP的產(chǎn)量大于3.9g/L。

圖11顯示了VB12與酵母膏對重組菌產(chǎn)3-HP性能的交互影響效應(yīng)，從圖11可以看出，VB12與酵母膏的交互作用不明顯，當VB12濃度在-0.4-0.5（0.03-0.075g/L）， 酵 母 膏 在0.3-0.6（6.2-7.4g/L）范圍時，3-HP的產(chǎn)量大于3.9g/L。

圖9 甘油與酵母膏對重組菌產(chǎn)3-HP的影響等高線圖及響應(yīng)面圖

圖10 VB12與KH2PO4對重組菌產(chǎn) 3-HP影響的等高線圖及響應(yīng)面圖

圖11 VB12與酵母膏對重組菌產(chǎn) 3-HP影響的等高線圖及響應(yīng)面圖

圖12顯示了KH2PO4與酵母膏對重組菌產(chǎn)3-HP性能的交互影響效應(yīng)，從圖12可以看出，當酵母膏濃度在 -0.4-0.7（4.84-5.8g/L），KH2PO4在 -0.3-0.8（4.8-8.4g/L）范圍時，3-HP的產(chǎn)量大于4.8g/L。對模型方程進行典型性分析說明，模型具有穩(wěn)定點，穩(wěn)定點為其最大值。培養(yǎng)基最優(yōu)組成為：甘油 62g/L、VB120.05g/L、KH2PO47.4g/L及酵母膏 6.2g/L，在此培養(yǎng)基中3-HP產(chǎn)量的最大估計值為5.4g/L。

圖12 KH2PO4與酵母膏對重組菌產(chǎn) 3-HP影響的等高線圖及響應(yīng)面圖

2.6 模型的驗證

以響應(yīng)面試驗優(yōu)化得到的最佳培養(yǎng)基配方組成為（g/L）：甘油 62g/L、VB120.05g/L、KH2PO47.4g/L及酵母膏 6.2g/L；在此培養(yǎng)基條件下，進行3次發(fā)酵試驗，發(fā)酵液中3-HP的濃度分別為5.2g/L，5.8g/L，5.3g/L與模型計算值5.4g/L相近似，預(yù)測值與試驗值之間的良好擬合性證實了模型的有效性及存在著極大值點，證明響應(yīng)面方法對培養(yǎng)基優(yōu)化有效。

3 討論

由于來源不同的質(zhì)粒在同一宿主細胞中存在著許多不定因素，對菌體的生長和外源基因的表達都有影響，最終對產(chǎn)物的生成也會造成一定影響。而質(zhì)粒的穩(wěn)定性是重組菌高水平發(fā)酵生產(chǎn)的一個基本條件，因此將甘油代謝產(chǎn)3-HP途徑中兩個關(guān)鍵酶基因進行串聯(lián)表達，可以有效的提高重組質(zhì)粒在宿主菌中的穩(wěn)定性，從而在一定程度上提高重組大腸桿菌合成3-HP的能力。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)3-HP可以有效避免化學合成的不利因素，從甘油到3-HP的生物合成途徑中，DHAB需要VB12作為輔酶才能催化甘油至3-羥基丙醛（3-HPA）的反應(yīng)［13］。Toraya等［14］研究表明，如果將與之結(jié)合的被修飾的輔酶B12或VB12與自由態(tài)輔酶B12進行交換，可以恢復DHAB的催化活性。維持發(fā)酵培養(yǎng)基中足夠高的VB12濃度，對于激活DHAB活性和防止因甘油導致的自殺性失活，從而保證較高水平3-HP的產(chǎn)量是必需的，合成途徑的唯一中間產(chǎn)物為3-羥基丙醛，其濃度過高將抑制菌體的生長和甘油的代謝［15］，從而抑制DHAB的活性。因此，要實現(xiàn)3-HP 在重組大腸桿菌的大量積累，DHAB的活性起著關(guān)鍵性作用，而如何實現(xiàn)其活力的提高將是以后研究的重點。

4 結(jié)論

將編碼乙醛脫氫酶編碼基因aldh連接重組質(zhì)粒pEtac-dhaB轉(zhuǎn)化大腸桿菌，成功構(gòu)建產(chǎn)3-羥基丙酸（3-HP）重組大腸桿菌JM109（pEtac-dhaB-aldh）。單因素試驗考察了甘油、 VB12、KH2PO4及酵母膏的濃度對重組菌發(fā)酵產(chǎn)3-HP的影響，進一步通過響應(yīng)面分析優(yōu)化了重組菌發(fā)酵培養(yǎng)基，優(yōu)化培養(yǎng)基組成為（g/L）：甘油62g/L、VB120.05g/L、KH2PO47.4g/L及酵母膏 6.2g/L，在此培養(yǎng)基中3-HP的產(chǎn)量為 5.8g/L。

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