楊曉燕 張波， 黃方愛(ài) 顏歡 李月榮 鄭秋生

從植物組織中提取RNA是進(jìn)行植物分子生物學(xué)方面研究的必要前提［1］，近年來(lái)發(fā)展的高通量測(cè)序技術(shù)，如轉(zhuǎn)錄組短槍測(cè)序法（Whole Transcriptome Shotgun Sequencing）、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-Seq）和高性能的生物信息分析技術(shù)對(duì)于RNA的質(zhì)量要求較高，這對(duì)RNA提取在完整性和純度方面有了更高的要求。

植物含有大量的多糖、多酚、代謝產(chǎn)物、色素等成分，增加了高質(zhì)量RNA的提取難度；由于種屬和取材部位的不同亦會(huì)造成提取策略個(gè)體化及復(fù)雜化，適合植物RNA提取的方法也不盡相同［2-5］。葡萄組織中就有多種次生代謝產(chǎn)物，較難提取到高質(zhì)量的RNA［6］，盡管國(guó)內(nèi)外的研究者已經(jīng)開(kāi)發(fā)出從葡萄組織中提取 RNA 的方法，如 SDS 法［7］、CTAB 法［8，9］、以及二者結(jié)合法等方法［10］。近年來(lái)，商業(yè)化的RNA提取試劑盒在一些植物樣品RNA提取中已被證明具有簡(jiǎn)單快捷，試驗(yàn)重復(fù)性較好的優(yōu)點(diǎn)。但對(duì)于高質(zhì)量尤其是滿足測(cè)序要求的樣本，其應(yīng)用效果尚待評(píng)價(jià)。為了滿足本課題對(duì)于葡萄葉片樣本RNA提取效果較高的需求，本研究擬對(duì)比3種新疆地區(qū)常見(jiàn)植物RNA提取試劑盒在葡萄葉片RNA提取中的效果，并針對(duì)葡萄葉片材料特性對(duì)試劑盒操作流程優(yōu)化，建立適合于RNA-Seq測(cè)序的葡萄葉片高質(zhì)量RNA提取方案。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為紅地球葡萄（Vitis vinifera L.cv.Red Globe）1月齡葉片，取自于石河子大學(xué)藥園。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 的提取方法 首先通過(guò)變性劑裂解破碎組織，然后經(jīng)過(guò)氯仿等有機(jī)溶劑變性蛋白并抽提RNA，最后將RNA經(jīng)過(guò)沉淀、洗滌、干燥并溶解待用。1.2.2.1 試劑盒A：UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒（生工生物工程股份有限公司，上海）。試劑盒B：RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）。試劑盒C：RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN公司，德國(guó)）步驟皆參照各自說(shuō)明書。

1.2.2.2 試劑盒方法改進(jìn) 參照試劑盒提供方法和流程，具體改進(jìn)策略詳，見(jiàn)表1。

表1 三種試劑盒提取葡萄葉片總RNA的改進(jìn)策略

1.2.2.3 總RNA檢測(cè)及純度分析 RNA樣品非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。各方法提取之RNA置于1％瓊脂糖凝膠（Biowest?regular agarose G-10，gene有限公司）上電泳，電壓120V，15min（恒流恒壓電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司），用凝膠成像系統(tǒng)（Bioshine GelX 1650凝膠成像系統(tǒng)，上海歐翔科學(xué)儀器有限公司）拍照記錄。

（1）濃度檢測(cè)方法：Qubit Fluorometer（美國(guó)invitrogen公司）；瓊脂糖凝膠電泳定量；Agilent 2100（美國(guó)安捷倫科技公司）。

（2）28S∶18S檢測(cè)方法：Agilent 2100（美國(guó)安捷倫公司）芯片分析儀自動(dòng)計(jì)算。

1.2.2.4 基因數(shù)字表達(dá)譜測(cè)序（RNA-Seq）參考文獻(xiàn)［11］及華大基因委托書技術(shù)內(nèi)容，試驗(yàn)流程簡(jiǎn)介如下：總RNA加熱打開(kāi)二級(jí)結(jié)構(gòu)后，帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，用試劑盒去除rRNA。向得到的mRNA中加入適量打斷試劑高溫條件下使其片段化，再以片段后的mRNA為模板，合成cDNA，經(jīng)過(guò)磁珠純化、末端修復(fù)、3'末端加堿基A、加測(cè)序接頭后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而完成整個(gè)文庫(kù)制備工作構(gòu)建好的文庫(kù)用Agilent 2100Bioanalyzer（美國(guó)安捷倫公司）以及ABI StepOnePlus Real-Time PCR System（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)ABI公司）進(jìn)行質(zhì)量和產(chǎn)量檢測(cè)，文庫(kù)質(zhì)控合格后使用Illumina HiSeqTM2000（美國(guó)Illumina公司）進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 RNA電泳分析

RNA質(zhì)量一般通過(guò)電泳和RNA特定吸光度的值共同來(lái)評(píng)價(jià)，在圖1中對(duì)比分析了條件優(yōu)化前后對(duì)試劑盒A、B、C提取結(jié)果的影響。采用試劑盒A推薦的方法提取的葡萄葉片RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后沒(méi)有條帶（優(yōu)化前試劑盒A所示），優(yōu)化后得到的RNA電泳條帶明顯出現(xiàn)，但伴隨有拖尾現(xiàn)象（優(yōu)化后試劑盒A所示）；采用試劑盒B推薦方法提取的RNA電泳條帶只有5S帶，且有彌散現(xiàn)象（優(yōu)化前試劑盒B所示），優(yōu)化后得到清晰的28S、18S和5S電泳條帶（優(yōu)化后試劑盒B所示）；采用試劑盒C推薦方法提取的RNA電泳條帶有不清晰的2個(gè)條帶，18S和5S（優(yōu)化前試劑盒C所示），優(yōu)化后得到清晰明亮的28S、18S和5S電泳條帶（優(yōu)化后試劑盒C所示）。

2.2 RNA純度、濃度檢測(cè)

從表2可以看出采用試劑盒A（編號(hào)1、2、3）改進(jìn)方法提取的RNA樣品原液濃度大于100ng，OD260/OD280在1.8-2.2之間，但是OD260/OD230均小于2。而采用試劑盒B（編號(hào)4、5、6）和試劑盒C（編號(hào)7、8、9）改進(jìn)方法提取的6個(gè)RNA樣品不但原液濃度大于100ng，而且OD260/OD280和OD260/OD230的值全都在1.8-2.2之間。為了保證后續(xù)試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，試驗(yàn)又采用Agilent 2100對(duì)3個(gè)試劑盒改進(jìn)法提取的RNA樣品純度和質(zhì)量進(jìn)行深度分析，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 三種試劑盒方法提取葡萄葉片總RNA電泳圖

通過(guò)Agilent 2100RNA芯片對(duì)提取的總RNA電泳結(jié)果質(zhì)量檢測(cè)，試劑盒A改進(jìn)方法提取的1號(hào)RNA樣品總范圍為151.2，濃度為117ng/μL，RNA完整性為8.10；2號(hào)RNA樣品總范圍為155.2，濃度為88ng/μL，RNA完整性為8.50；3號(hào)RNA樣品總范圍為103.9，濃度為99ng/μL，RNA完整性為8.40；試劑盒B改進(jìn)方法提取的4號(hào)RNA樣品總范圍為155.4，濃度為110ng/μL，RNA完整性為8.60；5號(hào)RNA樣品總范圍為136.7，濃度為97ng /μL，RNA完整性為8.00；6號(hào)RNA樣品總范圍為91.4，濃度為65ng/μL，RNA完整性為8.40；試劑盒C改進(jìn)方法提取的7號(hào)RNA樣品總范圍為485.2，濃度為199ng/μL，RNA完整性為8.00；8號(hào)RNA樣品總范圍為328.7，濃度為135ng/μL，RNA完整性為8.50；9號(hào)RNA樣品總范圍為505.5，濃度為190ng/μL，RNA完整性為7.40。

表2 Qubit Fluorometer 檢測(cè)3種試劑盒改進(jìn)方法提取的葡萄葉片總RNA純度及產(chǎn)量

從表3中可以看出，采用Agilent 2100RNA芯片檢測(cè)3個(gè)試劑盒改進(jìn)方法提取的9個(gè)RNA樣品28S條帶大小是18S的1.5-2.0倍。

2.3 RNA測(cè)序質(zhì)量評(píng)估

隨機(jī)選取試劑盒B和試劑盒C改進(jìn)方法提取的3個(gè)RNA樣品進(jìn)行基因數(shù)字表達(dá)譜測(cè)序（RNA-Seq）工作。結(jié)果如圖3所示，A、B、C 3個(gè)測(cè)序樣品的片段可讀性（Tags distribution）滿足RNA-Seq分析要求，其中完全測(cè)序（Clean reads）在A與C樣品超過(guò)了99％。此外，Containing adaptor是處理后依然含有標(biāo)簽序列的基因，Containing N是含有未知核苷酸的基因，Low quality是測(cè)序堿基峰值小于檢測(cè)閾值的基因，這些都屬于低質(zhì)量測(cè)序結(jié)果標(biāo)志。從圖3中可以看到，樣品中上述低質(zhì)量測(cè)序結(jié)果所占比重極小，說(shuō)明經(jīng)優(yōu)化的試劑盒提取的RNA的質(zhì)量是可以滿足測(cè)序要求的。

圖2 Agilent 2100 RNA芯片對(duì)提取的總RNA電泳結(jié)果質(zhì)量

表3 Agilent 2100 RNA芯片檢測(cè)提取總RNA質(zhì)量

圖3 測(cè)序樣品的Tag分布統(tǒng)計(jì)（n=3）

2.4 RNA測(cè)序基因覆蓋度

根據(jù)RNA-Seq的測(cè)序技術(shù)原理，在樣本的測(cè)序過(guò)程中，對(duì)目的基因在測(cè)序結(jié)果的覆蓋程度及這些基因數(shù)目進(jìn)行RNA測(cè)序基因覆蓋度分析。從圖4中可以看出，覆蓋度在60％以上的基因數(shù)占總基因數(shù)的比例A是47.76％，B是51.42％，C是55.48％。覆蓋度＞90％的基因數(shù)占總基因數(shù)的比例A是18.76％，B是20.46％，C是22.98％，這些結(jié)果表明，所獲得RNA的測(cè)序結(jié)果基因覆蓋度較高，達(dá)到了RNA-Seq分析的基本要求。

圖4 RNA測(cè)序基因覆蓋度統(tǒng)計(jì)

3 討論

高性能的RNA生物信息學(xué)研究在樣品完整性和純度方面對(duì)RNA提取技術(shù)有特殊的要求。相對(duì)于常規(guī)提取，樣品完整且無(wú)酶等抑制物殘留成為商品化的RNA提取試劑盒的基本技術(shù)指標(biāo)。實(shí)際使用過(guò)程中，提取策略往往需要針對(duì)具體樣品特點(diǎn)進(jìn)行條件優(yōu)化，延長(zhǎng)接觸時(shí)間是若干優(yōu)化中最經(jīng)濟(jì)的一種。本研究即針對(duì)葡萄葉樣本進(jìn)行提取策略的優(yōu)化，如表1所示適當(dāng)延長(zhǎng)提取環(huán)節(jié)相關(guān)試劑與樣品的接觸時(shí)間，可以在不增加提取成本的情況下顯著提升3種試劑盒的提取效果。

Trizol交換柱法是動(dòng)植物細(xì)胞RNA提取最常見(jiàn)試劑盒提取方法，適用面廣且操作簡(jiǎn)便，但在本研究中發(fā)現(xiàn)Trizol法RNA提取試劑盒A即使優(yōu)化后條件也無(wú)法滿足本試驗(yàn)提取質(zhì)量要求，這說(shuō)明針對(duì)葡萄葉樣品不建議使用這類寬泛型試劑盒。試劑盒B和C主要針對(duì)植物樣品，在優(yōu)化時(shí)間等條件后，B的電泳條帶28S和18S條帶清晰明亮，C的可以看到清晰的3條電泳條帶，提示提取的RNA完整性較好，說(shuō)明適合葡萄葉樣品提取。

分子生物學(xué)試驗(yàn)中對(duì)RNA質(zhì)控一般通過(guò)樣品吸光值比率進(jìn)行純度評(píng)估，OD260/OD280的比值用于估計(jì)核酸的純度（1.8-2.2）。但對(duì)于RNA-Seq需要額外OD260/OD230比值用于估計(jì)脫鹽和去多糖多酚的程度（＞2.0）［12，13］，蛋白去除不徹底會(huì)導(dǎo)致前者比值過(guò)低，脫鹽不完全或植物多糖與多酚的污染會(huì)導(dǎo)致后者比值過(guò)低［14］，這兩種指標(biāo)是保障高質(zhì)量RNA提取的重要判定標(biāo)準(zhǔn)。譬如試劑盒A改進(jìn)后3個(gè)RNA提取樣品OD260/OD280值在1.8-2.2之間，但是OD260/OD230都小于2，這種純度的RNA可以滿足RT-PCR試驗(yàn)需求，但無(wú)法保障RNA-Seq要求。而專門針對(duì)植物材料的試劑盒B和試劑盒C在優(yōu)化試驗(yàn)中取得了較理想的提取結(jié)果，通過(guò)Agilent 2100對(duì)樣品純度和完整性進(jìn)行深度分析發(fā)現(xiàn)采用改進(jìn)方法試劑盒B提取的RNA的28S∶18S的值都接近2，說(shuō)明試劑盒B優(yōu)化后提取的RNA質(zhì)量最佳。數(shù)字基因表達(dá)譜需要高純度和高完整性的RNA樣本，對(duì)比參考文獻(xiàn)［15，16］中數(shù)字基因表達(dá)譜（RNA-Seq）中RNA測(cè)序質(zhì)量評(píng)估和RNA測(cè)序基因覆蓋度的結(jié)果，本試驗(yàn)結(jié)果表明試劑盒B、C經(jīng)優(yōu)化條件后提取的葡萄葉片RNA滿足cDNA文庫(kù)構(gòu)建及RNA表達(dá)譜測(cè)序的工作需求。

4 結(jié)論

寬泛的Trizol提取法并不適合葡萄葉樣品高質(zhì)量RNA提取。即便是專門針對(duì)植物樣品的試劑盒其參數(shù)也需要根據(jù)具體樣品特點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化，推薦延長(zhǎng)試劑與提取樣品接觸時(shí)間。

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