高啟禹 徐光翠 陳紅麗 周晨妍

酶的固定化方法和技術(shù)研究是酶工程研究的重點之一，其核心是如何將游離的酶通過一定的方式與水不溶性的載體相結(jié)合，同時保持酶的催化活性和催化特性。固定化酶的概念自1953年由德國科學家Gubhofen［1］提出以來，先后經(jīng)過了實驗室研發(fā)到工業(yè)化生產(chǎn)的重大轉(zhuǎn)折，并建立了傳統(tǒng)的固定化酶的基本方法，如包埋法、交聯(lián)法、吸附法和共價結(jié)合法［2］。近年來，隨著結(jié)構(gòu)生物學、蛋白質(zhì)工程及材料科學的不斷發(fā)展，在酶的固定中出現(xiàn)了一些新型載體和新型技術(shù)，從而使酶在負載能力、酶活力和穩(wěn)定性等方面獲得了極大提高，且降低了酶在工農(nóng)業(yè)應用中的催化成本。這些載體和技術(shù)包括交聯(lián)酶聚集體、“點擊”化學技術(shù)、多孔支持物和最近的以納米粒子為基礎的酶的固定化［3］。納米材料作為酶固定化的新型載體，能夠體現(xiàn)良好的生物相容性、較大的比表面積、較小的顆粒直徑、較小的擴散限制、有效提高載酶量及在溶液中能穩(wěn)定存在等優(yōu)點［4］。固定化的微粒狀態(tài)根據(jù)納米材料物理形態(tài)的差異性可分為納米粒（包括納米球、納米囊）、納米纖維（包括納米管、納米線）、納米膜及納米塊等。目前，用于酶固定化的納米形態(tài)以納米粒（Nanoparticles，Nps）最為常見，納米粒通常指粒子尺寸在1-1000nm范圍內(nèi)的球狀或囊狀結(jié)構(gòu)的粒子。而用于酶固定的納米載體材料有磁性納米載體、非磁性納米載體等［5］。但是，在進行相關固定化設計時，仍然需嚴格遵循固定化酶的主要任務，即一方面要滿足應用上的催化要求；另一方面又要滿足在調(diào)節(jié)控制及分離上的非催化要求。

1 用于酶固定化的磁性納米載體

作為磁性納米材料由于其良好的活性功能基團（如-OH、-COOH、-CHO、-NH和-SH等）可結(jié)合各種功能分子，因而在酶的固定化領域已獲得了一定的應用（表1），同時磁性材料在生物醫(yī)學（臨床診斷、靶向藥物和酶標）、細胞學（細胞標記和細胞分離等）和生物工程（酶的固定化）及分離工程等方面發(fā)展迅速［6］。這種應用與納米材料的結(jié)構(gòu)特性緊密相關，如表面較平滑、單分散性好、結(jié)構(gòu)疏松等。除此之外，磁場能提供一種有效的酶回收的方法，可通過一定的磁力作用對具有磁性的納米載體進行回收，從而提高了產(chǎn)物的純度，避免了最終產(chǎn)品的酶污染。

表1 磁性納米載體在生物技術(shù)上的應用

采用磁性納米載體進行酶的固定對酶的酶活力和穩(wěn)定性、酶結(jié)構(gòu)和功能、酶特異性等酶學性質(zhì)有一定的提高，但在生物催化過程中需充分考慮生物催化劑的回收利用、經(jīng)濟效益及副產(chǎn)物的處置等，以達到最優(yōu)的固定化設計。Wang等［15］通過共沉淀法對Fe3O4納米粒子進行了表面不同鏈長度的烷基硅烷的修飾，獲得了改性的Fe3O4粒子，通過對脂肪酶的固定發(fā)現(xiàn)，固定化酶的活性及穩(wěn)定性與增加烷基鏈的長度有關。Sachin等［16］用新型磁性交聯(lián)的CLEAs顆粒固定了α-淀粉酶，研究發(fā)現(xiàn)α-淀粉酶被固定化后，其對底物的親和力得到增強，同時也提高了酶的熱穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性，即使在貯存42d后仍能保持近100％的酶活。Zhang等［17］成功地將腺苷脫氨酶固定在金納米（AuNP）微粒上，并用標記檢測證實了二者的連接。動力學研究表明，AuNP固定的腺苷脫氨酶仍具有較好的穩(wěn)定性和催化活性。Natalia等［18］探討了利用聚合有聚乙二醇的Fe3O4磁性納米粒子固定α-半乳糖苷酶的固定化效果。研究發(fā)現(xiàn)，酶與載體進行了有效的偶聯(lián)，但偶聯(lián)效率受納米粒子直徑大小等理化性質(zhì)的影響，同時在酶的熱穩(wěn)定性上得到了提高。Gardimalla等［19］研究了固定在Fe2O3磁性納米微粒上的假絲酵母脂肪酶在穩(wěn)定性方面的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用Fe2O3磁性納米微粒固定脂肪酶可以獲得比游離酶更長的可重復利用時間。Hong等［20］發(fā)現(xiàn)在空間位阻和靜電的共同作用下，結(jié)合在表面修飾的納米金顆粒表面的α-胰凝乳蛋白酶對攜帶正電荷的底物表現(xiàn)出很強的親和性，同時具有較高的催化活力，而對攜帶負電荷的底物僅表現(xiàn)很低的親和力和催化活力，對中性底物的親和力和催化能力居中。

2 非磁性納米載體上酶的固定化

非磁性納米載體通常由天然高分子材料和人工合成高分子材料制備，目前最常用的方法是利用反膠團進行聚合反應從而制備納米級高分子載體，然后再通過共價交聯(lián)或吸附的方法對酶進行固定化［21］。根據(jù)高分子材料的性質(zhì)可將其分為無機納米載體、有機納米載體和復合物納米載體等［22］。非磁性材料的磁電阻效應一般都比較低，因此在特殊的環(huán)境中能為酶的應用提供相對容易的調(diào)控，而且作為納米級的生物催化體系，在表面積/體積比上具有獨一無二的天然優(yōu)勢。目前，采用非磁性納米載體進行酶的固定已取得了系列研究成果（表2），同時隨著材料科學的進一步發(fā)展，必將有更多的新材料被應用于酶的固定化。

使用非磁性納米載體進行酶的固定前需用傅利葉變換紅外光譜、電鏡掃描、核磁共振、電感耦合技術(shù)及X射線光電子能譜等對納米微球體作性質(zhì)測定。同時為提高非磁性納米載體的固定化效果，通常需對載體表面進行相關的分子修飾（圖1），特別在以殼聚糖修飾的納米載體方面研究較為深入［32］。黃賦等［33］用靜電紡絲法制備了丙烯腈/丙烯酸共聚物（PANCAA）納米纖維膜，以1-乙基-3-（N，N-二甲基氨基丙基）碳二亞胺/Ⅳ-羥基丁二酰亞胺（EDC/NHS）為偶聯(lián)劑，在纖維膜表面引入殼聚糖修飾層，通過戊二醛將過氧化氫酶固定到殼聚糖修飾的PANCAA納米纖維膜上，研究結(jié)果表明，在殼聚糖濃度為25mg/mL及戊二醛質(zhì)量分數(shù)為5％條件下，殼聚糖修飾膜的固定化酶活性比空白膜提高了41.7％，穩(wěn)定性也得到了不同程度的提高。Eldin等［34］采用沉淀聚合法將乙二胺與聚丙烯腈-共-甲基丙烯酸納米微粒共價聯(lián)接，制備了聚丙烯腈-共-甲基丙烯酸甲酯（PAN-co-MMA）微球，通過對β-半乳糖苷酶的固定化發(fā)現(xiàn)，其催化活性、反應穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、貯藏穩(wěn)定性都有所提高。Liu等［35］報道了NAD（H）與SiO2納米微粒的共價聯(lián)接，并發(fā)現(xiàn)連接了NAD（H）的SiO2納米微?？蛇M行多酶共固，如將谷氨酸鹽脫氫酶、乳酸脫氫酶和NAD（H）固定后通過耦合反應用來催化生成α-酮戊二酸和乳酸，各種被固定的酶仍具有較好的活性和催化特性。Neri等［36］報道了用固定在聚硅氧烷-聚乙烯醇（POS-PVA）上的β-半乳糖苷酶來合成低聚半乳糖，研究發(fā)現(xiàn)，在pH4.5，溫度為40℃條件下，低聚半乳糖的合成濃度較高，而且固定化酶可重復利用10次，并保留有原酶活性的84％。

表2 非磁性納米載體對酶的固定及應用

圖1 殼聚糖結(jié)構(gòu)及殼聚糖修飾的納米粒模式圖

3 納米顆粒對核酶的固定化

脫氧核糖核酸（DNA）作為生命體的生物大分子，在生物體內(nèi)發(fā)揮著儲存、復制及傳遞遺傳信息的重要功能，其堿基序列的變異與人類許多遺傳疾病相關，基于DNA 探針的基因傳感器、基因芯片的研究正成為其中的一個研究熱點。特別自1989年，諾貝爾化學獎授予Thomas R.Cech及S.Altman以來，核酸分子的自我剪切或自我剪接的分子機制得到了進一步的研究和闡述，可對于核酶的固定化目前仍處于起始階段，但相對于其它固定化載體而言，由于通過表面修飾的納米顆粒與DNA具有良好的生物相容性，從而增加了DNA的固定量，增強了固定化DNA的穩(wěn)定性和定向性。目前DNA常用的固定化方法包括吸附法（直接吸附法、恒電位吸附法、靜電吸附法、LB 膜技術(shù)）、自組裝膜（self-assembly SA）法及親和素-生物素反應系統(tǒng)固定法［37］。常用到的納米顆粒有納米金、碳納米管、納米SiO2及ZrO2等［38］?？椎骂I等［39］以球形纖維素為載體，經(jīng)環(huán)氧氯丙烷活化后共價偶聯(lián)小牛胸腺DNA，制備DNA 免疫吸附劑，利用抗體抗原特異結(jié)合原理，通過血液凈化，可有效地清除患者體內(nèi)DNA 抗體及抗體復合物，達到治療目的。Li等［40］則利用嵌在SiO2基質(zhì)中垂直分布的碳納米管端口的羧基共價固定DNA。劉盛輝等［41］用了氨基乙硫醇在金電極表面形成自組裝單分子膜，然后用水溶性的碳化二亞胺作為偶聯(lián)活化劑，ssDNA 的5'端磷酸基與電極表面自組裝膜上的氨基以磷酸氨基酯鍵的形式共價結(jié)合，從而在金電極表面形成ssDNA 單分子層，從而有效地對DNA進行了固定。Cai等［42］把多壁碳納米管羧基化，從而在玻碳電極的表面形成了均勻的薄膜，使電極的有效面積得到了增加，再以吡咯為介質(zhì)在電極表面通過電聚合包埋法固定DNA，利用雜交前后電極阻抗的變化實現(xiàn)了DNA 的無指示劑雜交檢測。

4 結(jié)語

隨著納米新材料的不斷出現(xiàn)，特別是對復合納米材料性質(zhì)及特性的研究，為納米材料在酶固定化領域取得更加豐碩的成果成為可能。作為納米載體固定的酶，在酶與底物及產(chǎn)物的分離、酶的生物相容性、免疫活性和穩(wěn)定性等方面具有獨特的優(yōu)勢，而且由于引入的表面修飾劑的功能基團易于測定和掌握，因而為酶的定向固定提供了極佳的設計思路，同時也使多酶共固變得更加實際。但由于納米載體的設計相對比較困難，而且作為固定化材料在生產(chǎn)成本及能源消耗等方面還存在一定的劣勢，因而在后期采用納米材料進行酶的固定過程中，應改進現(xiàn)有納米材料制備的方法，同時，進一步優(yōu)化納米材料的比表面積及力學特性，增強其親和力和生物活性，從而為改善酶的性能及提高酶的應用奠定堅實的基礎。

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