楊 倩 謝艷華周暄宣 朱愛華 同卓斌 胡少婷 王四旺

1.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)教研室，陜西西安， 710032；2.陜西醫(yī)藥控股集團(tuán)公司陜西中藥研究所，陜西西安 710082

衰老是正常的生理現(xiàn)象，亦是自然規(guī)律。抗衰老一直是醫(yī)學(xué)界普遍關(guān)注的科學(xué)問題，但因衰老機(jī)制不明，防治衰老的藥物實(shí)無根本突破。英國學(xué)者Hatman 曾于1956年提出衰老的自由基學(xué)說，認(rèn)為人體內(nèi)存在清除自由基的防御系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物（GSH-Px）及維生素、氨基酸、金屬蛋白等；隨著年齡的增長，機(jī)體抗氧化防御物質(zhì)合成和活性下降，清除自由基能力降低，導(dǎo)致自由基代謝產(chǎn)物丙二醛（MDA）等大量堆積，加速機(jī)體的衰老[1-2]。中醫(yī)認(rèn)為，衰老與腎虛、腎精不足密切相關(guān)，補(bǔ)腎中藥是中藥延緩衰老的有效藥物。佳蓉片是我科室20 世紀(jì)90年代研制成功的主治更年期綜合征新藥（國藥證字Z20026690），經(jīng)多年臨床應(yīng)用證實(shí)，不僅對更年期綜合征具有明顯療效，而且發(fā)現(xiàn)能夠顯著改善衰老證侯，如減少面部皺紋、延緩絕經(jīng)期、促進(jìn)生育能力[3-5]。為什么佳蓉片會有如此功效呢？經(jīng)檢索和分析處方中倒卵葉五加可能具有抗衰老作用。為證實(shí)該推論，本研究設(shè)計(jì)了倒卵葉五加的抗衰老作用實(shí)驗(yàn)研究，以期探討倒卵葉五加和佳蓉片對亞急性衰老大鼠血清MDA 含量，GSH-Px 和SOD活性、總抗氧化能力（T-AOC）、以及睪丸組織中NO、iNOS含量的影響；評價(jià)倒卵葉五加及其復(fù)方的抗衰老作用。

1 材料與方法

1.1 試劑

D-半乳糖，批號201112B09，北京化學(xué)試劑公司，采用生理鹽水配成 6%的溶 液；SOD、MDA、GSH-P、T-AOC、NO、iNOS 試劑盒，南京建成生物工程研究所。倒卵葉五加浸膏，含生藥量3.8 g/g 浸膏，批號2011091201，由寶雞飲片出品；佳蓉片，批號201111032，陜西博愛制藥有限公司出品。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

SD 大鼠，8周齡，雄性 60只，體重 200～250 g[由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供，動物合格證號：SCXK（軍）字第2007-007 號]。隨機(jī)分為正常組、模型組、倒卵葉五加組、佳蓉片組、維生素E 組，每組12只大鼠。D-半乳糖連續(xù)腹腔注射（320 mg/kg，50 d）建立亞急性衰老大鼠模型，各組大鼠在腹腔注射D-半乳糖 （正常組動物注射等量生理鹽水）的同時(shí)，正常和模型組大鼠灌胃生理鹽水（10 ml/kg）、其他各組依次給予倒卵葉五加（1 g/kg）、佳蓉片（6 g/kg）、維生素 E（20 mg/kg），用藥 50 d。

1.3 抗氧化指標(biāo)檢測

大鼠末次給藥后，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，內(nèi)眥取血2 mL，離心取上清；按照TBA 法檢測MDA 含量，比色法檢測GSH-Px，黃嘌呤氧化酶法檢測SOD，鐵還原法檢測T-AOC 等指標(biāo)。

1.4 NO、iNOS 含量

大鼠斷頭處死，每只大鼠取左側(cè)睪丸組織約100 mg 濾紙吸干水分后稱重，冰浴條件下切成小米粒大小組織塊，加入適量冷生理鹽水，制成10%組織勻漿，4 000 r/min離心12 min，取勻漿上清，以冷生理鹽水稀釋成需要濃度，酶標(biāo)儀測定組織蛋白含量，按照試劑盒說明進(jìn)行操作，測定睪丸組織N0、iNOS的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間對比采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01 為差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗氧化能力的影響

模型組大鼠MDA 含量明顯升高，GSH-Px、SOD 活性T-AOC 明顯降低，與正常組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01 或P＜0.05）。倒卵葉五加、佳蓉片和維生素E 明顯抑制衰老大鼠MDA 含量升高；顯著升高GSH-Px、SOD、T-AOC活性，各試藥組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。 見表1。

表1 大鼠各指標(biāo)檢測結(jié)果（±s，n=12）

表1 大鼠各指標(biāo)檢測結(jié)果（±s，n=12）

注：與模型組比較，*P＜0.01，**P＜0.05

組別 MDA（nmol/mL）GSH-Px（U/mL）SOD（U/mL）T-AOC（U/mL）正常組模型組倒卵葉五加組佳蓉片組維生素E 組2.35±0.75*5.12±0.94 2.51±0.70*2.45±0.69*2.41±0.64*19125±430**1410±259 4148±398**4208±3021**5023±289**201±22**147±19 198±18*189±19*210±23**201±22**147±19 198±18*189±19*210±23**

2.2 睪丸組織NO 和iNOS的含量

模型大鼠睪丸組織NO 和iNOS的含量明顯升高，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）；倒卵葉五加、佳蓉片和維生素E 顯著降低睪丸組織NO 和iNOS含量，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠睪丸組織NO和iNOS的含量（±s，n=12）

表2 各組大鼠睪丸組織NO和iNOS的含量（±s，n=12）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 體重（g） NO[U/（mg ·prot）] iNOS[U/（mg ·prot）]正常組模型組倒卵葉五加組佳蓉片組維生素E 組280.3±23.00 268.8±21 277.3±24 279.5±22 280.5±30 2.44±0.15**5.40±0.352.38±0.42**2.43±0.19**2.45±0.20**29.88±1.35*51.40±1.89 33.49±1.55*34.21±1.66*32.38±1.65*

3 討論

劉國強(qiáng)等[6]報(bào)道，MDA的含量可代表脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的濃度，間接反映組織的損傷程度。所以，MDA是機(jī)體衰老過程中產(chǎn)生的過量超氧陰離子自由基與脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物[7]。GSH-Px是機(jī)體廣泛存在的重要的過氧化物分解酶，其功能是催化谷胱甘肽（GSH）參與過氧化反應(yīng)，清除細(xì)胞在呼吸代謝過程中產(chǎn)生的過氧化物和羥自由基，從而減輕不飽和脂肪酸的過氧化作用。Giardino 等[8]早在2002年就證實(shí)，隨著年齡增加機(jī)體氧化還原平衡逐漸被打破，過氧化產(chǎn)物不斷積累、抗氧化物質(zhì)的含量明顯下降，導(dǎo)致衰老。正常情況下，SOD的功能是清除體內(nèi)新陳代謝過程中產(chǎn)生的自由基，使機(jī)體氧化與抗氧化保持平衡[9]；T-AOC 反映體內(nèi)酶性和非酶性抗氧化物的總水平，血清T-AOC 含量是全面評估機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)。

倒卵葉五加是佳蓉片中的君藥。倒卵葉五加具有健脾益氣、補(bǔ)腎寧心、舒筋活絡(luò)的功能，適用于體虛乏力、食欲不振、腰膝酸軟、陽痿、失眠多夢、健忘、風(fēng)寒濕痹等。本研究證實(shí)，D-半乳糖致模型大鼠血清MDA 含量明顯升高，SOD、GSH-Px 活性、T-AOC 明顯下降， 說明模型大鼠抗氧化能力明顯降低；倒卵葉五加、佳蓉片和維生素E 能明顯降低D-半乳糖誘發(fā)的衰老大鼠血清MDA 含量，升高SOD、GSH-Px、T-AOC 含量；這不僅說明倒卵葉五加具有顯著抗氧化應(yīng)激能力并發(fā)揮抗衰老作用，同時(shí)也提示佳蓉片臨床應(yīng)用表現(xiàn)出的具有一定延緩衰老的功效應(yīng)該與其君藥地位密切相關(guān)。

細(xì)胞的能量代謝障礙及凋亡是多種器官衰老退化的重要基礎(chǔ)，NO 能直接調(diào)控氧與血紅素的結(jié)合與釋放，進(jìn)而控制對線粒體的氧供給，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)[10]水平下降，引起細(xì)胞凋亡[11]；睪丸組織是雄性生物生殖能力的重要器官，由此中醫(yī)稱“腎乃先天之本，生命之源”。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，D-半乳糖致衰老大鼠睪丸組織NO、iNOS的含量均明顯增高，與文獻(xiàn)報(bào)道[12]一致；采用倒卵葉五加、佳蓉片和維生素E 干預(yù)，能明顯降低衰老大鼠睪丸組織NO 和iNOS的含量，說明倒卵葉五加等可通過調(diào)節(jié)睪丸組織NO、iNOS的含量抑制細(xì)胞凋亡，從而延緩睪丸組織的衰老。但是，倒卵葉五加是佳蓉片的君藥，臨床主適應(yīng)證是用于婦女更年期綜合征，那么，對雌性生殖器官的作用如何，本課題組的研究尚在進(jìn)行中。

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