程繼明 周翔魚 白向東 (銀川市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，寧夏 銀川 750001)

老年性癡呆(AD)是老年人中常見的神經(jīng)退行性疾病，80歲以上老年人高發(fā)，病人出現(xiàn)認知障礙和學習記憶能力的損傷。AD發(fā)病機制尚不明確，目前有氧自由基學說、β樣淀粉蛋白沉積學說、Tau蛋白過度磷酸化學說等。AD主要病理改變?yōu)槔夏臧?、神?jīng)纖維纏結(jié)和突觸丟失。自由基造成的氧化損傷也參與了AD發(fā)病過程〔1〕。老年人自由基清除能力下降，導致出現(xiàn)大量自由基，從而損傷細胞功能，加速AD發(fā)病。過氧化氫酶(CAT)和谷胱苷肽過氧化物酶(GSH-PX)兩者協(xié)同對抗體內(nèi)自由基，保護細胞功能和結(jié)構(gòu)完整功能。丹酚酸B(Sal B)是中藥丹參的主要成分，以往研究表明Sal B具有抗氧化、抗β淀粉樣蛋白導致的細胞毒性〔2〕。Sal B還能促進血管再生，促進神經(jīng)發(fā)生。以往報道顯示Sal B可以保護血管性癡呆動物模型大鼠的學習記憶能力和血管功能。但是Sal B在AD模型中的作用尚不明確。本實驗旨在觀察Sal B在東莨菪堿模型的作用。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 雄性SD大鼠購買自華中科技大學協(xié)和醫(yī)院動物實驗中心。大鼠隨機分成空白組、模型組和治療組。模型組大鼠腹腔注射東莨菪堿2 mg/kg，治療組腹腔注射東莨菪堿2 mg/kg，36 mg/kg Sal B溶于1 ml蒸餾水中灌胃?？瞻捉M給予相應的生理鹽水處理，每天處理一次，連續(xù)處理7 d。

1.2 試劑 東莨菪堿購買自天津市福順化學試劑廠。CAT試劑盒、GSH-PX測試盒購買自南京建成生物工程研究所。Western印跡所用抗體購買自Abcam公司。

1.3 Morris水迷宮 SD大鼠造模1 w后進行水迷宮實驗，水迷宮由一個內(nèi)壁及底部為黑色的圓柱形水池構(gòu)成，直徑150 cm，高50 cm，分為4個象限，第Ⅲ象限中央放一個30 cm的透明有機玻璃平臺，迷宮及平臺位置整個實驗過程中均保持不變。水溫控制在23℃。大鼠從水池邊上每個象限中點放入水池，軟件記錄大鼠在60 s內(nèi)找到第Ⅲ象限內(nèi)平臺的時間，即潛伏期。讓大鼠在平臺上放置20 s，連續(xù)訓練6 d，第7天撤除平臺檢測大鼠的潛伏期和穿越平臺的次數(shù)。

1.4 免疫印跡 10%SDS-PAGE膠電泳，濕式轉(zhuǎn)移法將膠里面的蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上，含3%牛血清白蛋白的TBS溶液封閉30 min，一抗4℃封閉過夜，T-TBS漂洗后，HRP結(jié)合的二抗以1∶1 000孵育1 h，DAB 顯色，照相留底。

1.5 CAT活力測定 稱取海馬組織重量，置于9倍生理鹽水中，電動勻漿器研磨成10%組織勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清10 μl，加入9倍的生理鹽水，變?yōu)?%的海馬勻漿液100 μl，按試劑盒說明書進行操作。最后405 nm處測OD值。

1.6 GSH-PX活力測定 稱取海馬組織重量，置于9倍生理鹽水中，電動勻漿器研磨成10%組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清 10 μl，加入 390 μl生理鹽水，變成 0.25% 的海馬勻漿液400 μl，按照試劑盒說明書進行操作。最后412 nm處測OD值。

2 結(jié)果

2.1 Sal B顯著改善AD大鼠的學習記憶能力 隨著時間推移，各組大鼠尋找平臺的潛伏期逐漸縮短，學習能增強記憶能力。但是模型組和空白組相比，其潛伏期明顯延長(P＜0.01);治療組和模型組相比，治療組的潛伏期顯著縮短(P＜0.01)。見表1、表2。

2.2 各組大鼠CAT、GSH-PX比較 由表3能夠看出模型組大鼠海馬中CAT活性顯著下降(P＜0.05)。經(jīng)Sal B治療后，模型組大鼠海馬的CAT活性明顯提高(P＜0.05)。模型組大鼠海馬中GSH-PX活性顯著下降(P＜0.05)。經(jīng)Sal B治療后，模型組大鼠海馬的GSH-PX活性明顯提高(P＜0.05)。

2.3 各組凋亡相關(guān)蛋白 模型組bcl-2明顯下降(P＜0.01)，caspase-3激活(P＜0.01);給予Sal B處理后，bcl-2表達量上升，caspase-3激活被抑制(P＜0.01)。見圖1。

表1 各組大鼠學習期間每日平均潛伏期(±s ，s，n=12)

表1 各組大鼠學習期間每日平均潛伏期(±s ，s，n=12)

1)與空白組比較，2)與模型組比較:P＜0.01;下表同

組別 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天空白組 60.0±0 40.2±3.4 28.2±3.5 16.0±4.2 9.1±2.8 8.7±3.1模型組 60.0±0 54.6±5.61) 48.3±4.31) 37.5±4.21) 32.3±4.31) 26.2±4.31)治療組 60.0±0 45.0±3.22) 33.3±4.02) 20.0±4.32) 12.4±4.22) 12.2±3.22)

表2 各組大鼠空間記憶實驗結(jié)果(±s ，n=12)

表2 各組大鼠空間記憶實驗結(jié)果(±s ，n=12)

組別 第Ⅲ象限停留時間(s) 穿越平臺次數(shù)(次)空白組45.3±2.2 6.2±1.21模型組 21.1±4.31) 3.3±2.11)治療組 40.1±3.12) 5.3±2.22)

表3 各組大鼠海馬組織CAT活力比較(±s，n=10)

表3 各組大鼠海馬組織CAT活力比較(±s，n=10)

組別 CAT(U/mgprot) GSH-PX(U/mgprot)空白組18.3±1.2 162.2±14.5模型組 12.1±1.41) 136.4±13.41)治療組 17.5±1.32) 155.6±13.32)

圖1 凋亡相關(guān)分子的表達變化

3 討論

AD的主要病理變化是β淀粉樣蛋白沉積、tau蛋白過度磷酸化和突觸丟失，它的發(fā)病機制有多種學說，但都無法做出全面解釋。東莨菪堿是一種M受體的拮抗劑，腹腔注射可導致大鼠的空間學習記憶能力出現(xiàn)障礙，被廣泛應用來模仿AD病人的記憶損傷〔3〕。

Sal B是從丹參中分離出來的主要水溶性酚酸類的化合物，是丹參中重要的活性部位之一，它在水溶性酚酸類化合物的活性成分中含量高于50%〔4〕。以往研究顯示Sal B具有抗氧化、對抗β淀粉樣蛋白誘導的細胞毒性、促進血管內(nèi)皮增殖等功能〔5〕。鐘靜等〔6〕報道Sal B能夠促進腦缺血后海馬齒狀回顆粒下層和側(cè)腦室下層神經(jīng)干細胞增殖和分化，在腦缺血損傷中發(fā)揮重要的保護作用。張敏等〔7，8〕報道Sal B可以上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子的mRNA水平和蛋白水平，能夠保護血管性癡呆動物模型的學習記憶能力。

本實驗表明Sal B可以改善AD模型大鼠的空間學習記憶能力(P＜0.01)，其機制可能是通過改善AD模型大鼠的抗氧化應激和抗凋亡能力來實現(xiàn)的。本實驗為進一步研究AD的治療提供了理論和實驗依據(jù)。

1 Ballard C，Gauthier S，Corbett A，et al.Alzheimer's disease〔J〕.Lancet，2011;377(9770):1019-31.

2 岳喜典，曲桂武，李桂生，等.丹參酚酸B在水溶液中的穩(wěn)定性研究〔J〕.中草藥，2005;36(2):205-7.

3 徐建民俞海燕.不同劑量的東莨菪堿對大鼠學習記憶能力的影響〔J〕.蘇州大學學報:醫(yī)學版，2006;26(1):53-4.

4 Tang MK，Zhang JT.Salvianolic acid B inhibits fibril formation and neurotoxicity of amyloid beta-protein in vitro〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2001;22(4):380-4.

5 Zhang RL，Zhang ZG，Zhang L，et al.Proliferation and differentiation of progenitor cells in the cortex and the subventricular zone in the adult rat after focal cerebral ischemia〔J〕.Neuroscience，2001;105(1):33-41.

6 鐘 靜，唐民科，張 妍，等.丹酚酸B對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)細胞損傷和神經(jīng)發(fā)生的影響〔J〕.藥學學報，2007;42(7):716-21.

7 張 敏，李永江，陳 粲.丹銀提取物對VD模型大鼠學習記憶和海馬VEGF表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(7):2700-1.

8 薛 亮，范英昌，李慶雯，等.丹酚酸B對離體培養(yǎng)內(nèi)皮祖細胞VEGF、bFGF mRNA表達及抗氧化酶活性的影響〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(1):236-8.