楊建生 潘 娟 (河南中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院麻醉科，河南 鄭州 450000)

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)表現(xiàn)為定向力、學(xué)習(xí)、記憶、注意等方面的認(rèn)知功能下降，術(shù)后人格改變、記憶受損、社交及認(rèn)知能力降低，多見(jiàn)于老年人〔1〕。環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(CREB)作為轉(zhuǎn)錄因子，在長(zhǎng)時(shí)程記憶的過(guò)程中起重要作用〔2〕。突觸素P38可調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放、參與突觸囊泡的導(dǎo)入、轉(zhuǎn)運(yùn)、再循環(huán)和突觸發(fā)生，是學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中的重要分子之一〔3〕。作為新型的靜脈全麻藥，乳化異氟醚可直接靜脈應(yīng)用，在治療指數(shù)相似的前提下，其麻醉誘導(dǎo)作用及復(fù)蘇均優(yōu)于丙泊酚〔4〕，具有良好的臨床應(yīng)用前景，但對(duì)于其術(shù)后認(rèn)知功能的影響尚缺乏認(rèn)識(shí)。本研究選用老齡SD大鼠做麻醉模型，利用Morris水迷宮的記憶提取測(cè)試〔5〕，研究乳化異氟醚對(duì)大鼠記憶提取及CREB和P38表達(dá)的影響，探討乳化異氟醚對(duì)記憶認(rèn)知功能的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 健康SD雄性老年大鼠36只，體重為400～500 g(鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。隨機(jī)分為空白對(duì)照組(C組，n=6)、30%脂肪乳組(E組，n=6)、8%乳化異氟醚組(EI組，n=24)，EI組共分 4個(gè)亞組(即 EI麻醉蘇醒后 6 h、24 h、72 h、7 d 組，每組 n=6)。

1.2 藥品和儀器 8%乳化異氟醚(委托鄭州大學(xué)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室配制，以30%脂肪乳為載體，配制成液態(tài)異氟醚120 mg/ml、濃度為8%的制劑);30%脂肪乳(批號(hào):20110509，西安力邦制藥有限公司);大鼠Morris水迷宮測(cè)試儀(上海軟隆科技發(fā)展有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 模型制備 麻醉前全部大鼠另加10只(候補(bǔ))行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，其中定位航行實(shí)驗(yàn)持續(xù)7 d，每天3次，在一圓形

水池中注滿(mǎn)水，水池均分為4個(gè)象限(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)，將平臺(tái)置于Ⅰ象限，水面高于平臺(tái)1～2 cm，將大鼠面向池壁按東、南、西、北4個(gè)入水點(diǎn)分次放入水中，記錄其尋找到隱藏在水面下平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)另加;第7天結(jié)束后2 h行探索實(shí)驗(yàn)，去除平臺(tái)，從將大鼠從Ⅲ象限投入水中將大鼠放入水中，記錄大鼠120 s內(nèi)在平臺(tái)象限停留時(shí)間，考察其對(duì)原平臺(tái)的記憶。平臺(tái)象限游泳的距離百分比超過(guò)30%表明參與大鼠形成了對(duì)平臺(tái)位置的空間記憶，以此為大鼠入選標(biāo)準(zhǔn)。不及格者或多余者剔除。水迷宮實(shí)驗(yàn)于每日16時(shí)至20時(shí)完成，此后，各組行尾靜脈穿刺，EI組靜脈注射8%乳化異氟醚1.5 ml/kg。EI組以大鼠前爪翻正反射消失，夾尾反射消失為麻醉成功標(biāo)準(zhǔn)。E組給予等容量30%脂肪乳;C組給予等容量生理鹽水。

1.3.2 行為學(xué)測(cè)試 停藥到翻正反射恢復(fù)即表示麻醉蘇醒。C組、E組于給藥后6 h再次進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，EI分別于麻醉蘇醒后6 h、24 h、72 h、7 d時(shí)各取6只大鼠行水迷宮實(shí)驗(yàn)，每次定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后2 h行探索實(shí)驗(yàn)。記錄數(shù)據(jù)。

1.3.3 CREB(p-CREB)及突觸素P38的表達(dá)測(cè)定 行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 ml/kg)后頸椎脫臼法處死大鼠，取海馬組織200 mg，各100 mg低溫狀態(tài)下加入裂解液(1 mg∶4 μl)進(jìn)行組織裂解，勻漿，離心等操作后提取上清液，此即為全蛋白提取物，BCA法進(jìn)行蛋白定量。將全蛋白提取物進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后，置于相應(yīng)的一抗稀釋液4℃緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜。洗膜，置于相應(yīng)的二抗稀釋液中，室溫孵育1 h。洗膜，孵育底物，化學(xué)發(fā)光顯色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0系統(tǒng)分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s表示，組間兩兩比較采用多組定量資料的單因素方差分析LSD法。

2 結(jié)果

2.1 各組水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 E組與C組間各指標(biāo)比較無(wú)差異(P＞0.05);與C組比較，EI組麻醉蘇醒后6 h、24 h時(shí)逃避潛伏期延長(zhǎng)，平臺(tái)象限停留時(shí)間縮短;72 h、7 d時(shí)各指標(biāo)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與麻醉蘇醒后6 h時(shí)比較，72 h、7 d時(shí)逃避潛伏期縮短及平臺(tái)象限停留時(shí)間延長(zhǎng)(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期及平臺(tái)象限停留時(shí)間比較(n=6，±s)

表1 各組大鼠逃避潛伏期及平臺(tái)象限停留時(shí)間比較(n=6，±s)

與C組比較:1)P＜0.01;與麻醉蘇醒后6 h時(shí)比較:2)P＜0.05

組別 逃避潛伏期(s) 平臺(tái)象限停留時(shí)間(s)C組 處理后6 h 14.67±2.4 50.33±3.98 E組 處理后6 h 14.00±1.4 48.01±6.23 EI組麻醉蘇醒后6 h 19.00±1.41) 40.00±2.371)麻醉蘇醒后24 h 17.67±2.421) 39.67±2.161)麻醉蘇醒后72 h 14.00±1.792) 47.50±4.512)麻醉蘇醒后7 d 12.67±1.032) 50.02±5.292)

2.2 各組CREB、突觸素P38表達(dá) E組與C組間各指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與C組比較，EI組麻醉蘇醒后6 h、24 h時(shí)海馬CREB(p-CREB)及突觸素P38表達(dá)下調(diào)(P＜0.05);72 h、7 d時(shí)各指標(biāo)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與麻醉蘇醒后 6 h時(shí)比較，EI組 72 h、7 d時(shí)海馬組織 CREB(p-CREB)及突觸素P38含量增高(P＜0.05)。Western印跡結(jié)果見(jiàn)圖1，圖2。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)p-CREB蛋白電泳圖

圖2 各組大鼠海馬區(qū)P38蛋白電泳圖

3 討論

POCD屬術(shù)后中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥之一，表現(xiàn)為記憶受損或人格改變，可伴有語(yǔ)言總結(jié)能力降低和行為異常〔6〕。老年患者組織器官發(fā)生退行性改變，對(duì)圍術(shù)期傷害性刺激引起的應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)能力降低，是發(fā)生POCD的高危人群〔7〕，隨著接受手術(shù)者人口基數(shù)增加，發(fā)病人數(shù)逐年增高，臨床工作不容忽視。

已證實(shí)EI靜脈應(yīng)用可產(chǎn)生確切而可逆的麻醉作用，兼具靜脈和吸人揮發(fā)性麻醉藥的優(yōu)點(diǎn)，在治療指數(shù)相似的情況下，EI的麻醉誘導(dǎo)與麻醉復(fù)蘇均優(yōu)于丙泊酚〔8〕，且乳化異氟醚在大鼠靜脈注射時(shí)的ED50和LD50分別為:0.07和0.22 ml/kg，用量小〔4〕，故EI具有良好的臨床應(yīng)用前景。但其對(duì)術(shù)后認(rèn)知功能的影響缺乏進(jìn)一步的研究。

Morris水迷宮是研究腦學(xué)習(xí)記憶機(jī)制的一種實(shí)驗(yàn)手段，其中定位航行實(shí)驗(yàn)可反映動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力，空間搜索實(shí)驗(yàn)反映動(dòng)物的空間聯(lián)想能力及回憶探究能力。由于C組和E組在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的行為學(xué)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，遵照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)“少量”的原則，在后續(xù)蛋白檢測(cè)中未進(jìn)一步分組。同時(shí)參照大鼠異氟醚麻醉后 POCD的研究結(jié)果，設(shè)置4個(gè)時(shí)間點(diǎn);用藥劑量(1.5 ml/kg)〔8〕。本研究提示，乳化異氟醚麻醉后可引起認(rèn)知功能、回憶提取功能下降，但其影響呈一過(guò)性，72 h后基本恢復(fù)。認(rèn)知功能是大腦高級(jí)功能，包括學(xué)習(xí)記憶的形成及記憶的提取。CREB與空間記憶的形成密切相關(guān)，并在神經(jīng)元的可塑性和大腦長(zhǎng)期記憶的形成中起重要作用。Guzowski等〔9〕在轉(zhuǎn)基因小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，CREB在恐懼記憶的鞏固及提取再鞏固的過(guò)程起重要作用。

突觸素P38是一種鈣結(jié)合糖蛋白，其構(gòu)成突觸囊泡特異性的膜通道，參與囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)和遞質(zhì)的釋放，與突觸可塑性關(guān)系密切，在培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元突觸發(fā)育時(shí)伴隨突觸素P38高水平表達(dá)〔10〕。同時(shí)突觸素還是突觸傳遞效能的反映〔12〕，因而突觸素蛋白可以反映突觸的信息傳遞及遞質(zhì)釋放，亦可反映神經(jīng)傳遞的增減及認(rèn)知功能的強(qiáng)弱〔11，12〕。本研究中，EI組 6 h、24 h認(rèn)知功能、回憶提取功能降低，同時(shí)伴有CREB、P38表達(dá)的減低，印證了CREB在記憶提取過(guò)程中的作用以及突觸素P38在記憶形成和遞質(zhì)傳遞中的作用，并在分子生物學(xué)層面驗(yàn)證了麻醉后大鼠認(rèn)知功能的下降;72 h、7 d時(shí)行為學(xué)測(cè)試成績(jī)較6 h、24 h相比有提升，與C組相較，無(wú)明顯差異，同時(shí)CREB和P38的表達(dá)量有增加，進(jìn)一步明確了CREB、P38在認(rèn)知過(guò)程中的作用，并提示乳化異氟醚所致POCD呈一過(guò)性，麻醉結(jié)束后72 h可恢復(fù)，為可逆性改變。

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