潘奇正 侯 雪 時(shí)佳宏 呂京懋 王 清 孫景春

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院麻醉科，吉林 長春 130021)

有機(jī)磷農(nóng)藥是目前我國使用最多的農(nóng)藥，有機(jī)磷酸酯類化合物極易溶解于油脂中并且很少或基本不溶解于水中，易經(jīng)呼吸道、消化道及皮膚吸收進(jìn)入機(jī)體內(nèi)。急性有機(jī)磷中毒的主要機(jī)制是膽堿酯酶抑制學(xué)說，有機(jī)磷可抑制乙酰膽堿酯酶的活性，使機(jī)體內(nèi)積累的乙酰膽堿持續(xù)、過度地刺激神經(jīng)系統(tǒng)〔1～3〕。同時(shí)由于其良好的脂溶性，有利于其與細(xì)胞膜的相互作用，并導(dǎo)致磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的改變，并增強(qiáng)活性氧簇(ROS)的生成量〔4〕;從而破壞機(jī)體的氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的平衡〔5〕，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，引起多種疾病如糖尿病、腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔6，7〕;對健康的毒性作用也是極大的，如神經(jīng)毒性、生殖毒性、心血管毒性、內(nèi)分泌毒性等。目前關(guān)于氧化樂果對大鼠脂代謝影響的研究未見報(bào)道，機(jī)制也不清楚，本實(shí)驗(yàn)觀察氧化樂果對大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平及脂代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和主要試劑 雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量為180～200 g，購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心(合格證號:2007-003)。氧化樂果，購自河北新興化工有限責(zé)任公司。丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、過氧化氫酶(CAT)測試盒及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測試盒購自南京建成生物工程研究所;甲醇、正丁醇及氫氧化鉀等試劑購自北京化工廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組和給藥 適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠后，隨機(jī)分為正常對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組各10只。低劑量組、中劑量組和高劑量組每天分別給予1/20、1/10、1/5 LD50的氧化樂果，正常對照組給予生理鹽水。采用灌胃的途徑給藥，每日灌胃一次，連續(xù)給藥2個月。每隔2 d稱量一次大鼠體質(zhì)量。

1.3 血清樣本的采集 連續(xù)給藥2個月后，大鼠眼球取血，4℃靜置1 h，4 000 r/min，離心 15 min，取上清液，分裝，－80℃保存待測。

1.4 MDA含量測定 采用硫代巴比妥酸反應(yīng)比色法，脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)生的MDA可與硫代巴比妥酸形成粉紅色的三甲川(3，5，5-三甲基惡唑-2，4-酮)，三甲川在 534 nm 處有一吸收高峰，利用在534 nm處的消光系數(shù)即可計(jì)算出組織中MDA的含量。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 SOD測定 通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基(·)，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈紫紅色，當(dāng)被測樣品中含SOD時(shí)，則對超氧陰離子自由基有專一的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時(shí)測定管的吸光度值低于對照管的吸光度值，通過公式計(jì)算可求出組織中的SOD活力。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 CAT測定 CAT分解H2O2的反應(yīng)可通過加入鉬酸銨而迅速中止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物，在405 nm處測定其生成量，通過計(jì)算可測得CAT的活力。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 GSH-Px測定 GSH-Px可以促進(jìn)H2O2與還原型谷胱甘肽(GSH)反應(yīng)，生成H2O及氧化型谷胱甘肽(GSSG)。GSH-Px的活力可以用其酶促反應(yīng)的速度來表示，測定此酶促反應(yīng)中GSH的消耗，可計(jì)算出GSH-Px的活力。同時(shí)GSH可以與二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基苯甲酸陰離子，呈黃色，在412 nm處測其吸光度即可計(jì)算出GSH的量。由于GSH能進(jìn)行非酶反應(yīng)氧化，所以最后計(jì)算此酶的活力時(shí)，必須扣除非酶反應(yīng)引起的GSH減少。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 TG、TC和LDL含量測定 取大鼠血清200 μl，應(yīng)用全自動生化分析儀測定大鼠血清中TG、TC、LDL和HDL含量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量變化 隨著氧化樂果暴露時(shí)間的持續(xù)，低劑量、中劑量和高劑量組大鼠體質(zhì)量增加量減少。給藥2個月時(shí)，與正常對照組相比，低劑量、中劑量和高劑量組大鼠體質(zhì)量顯著降低(P＜0.05);高劑量組大鼠體重明顯低于低劑量組和中劑量組(P＜0.05)。見圖1。

圖1 氧化樂果連續(xù)給藥2個月大鼠的體重變化

2.2 氧化樂果對各組大鼠血清抗氧化物酶活性的影響 與正常對照組相比較，低劑量、中劑量和高劑量組大鼠SOD、CAT和GSH-Px活性顯著升高(P＜0.05)，高劑量組大鼠SOD和CAT活性顯著高于低劑量和中劑量組(P＜0.05)。見表1。

表1 氧化樂果對各組大鼠血清抗氧化物酶活性的比較(±s ，U/ml，n=10)

表1 氧化樂果對各組大鼠血清抗氧化物酶活性的比較(±s ，U/ml，n=10)

組別SOD CAT GSH-Px正常對照組1.89±0.04 6.33±0.92 189±3.9低劑量組 1.57±0.04 3.17±0.34 178.3±5.34中劑量組 1.19±0.05 2.04±0.27 142±7.45高劑量組0.83±0.03 0.83±0.33 135.9±9.04

2.3 氧化樂果對各組大鼠脂代謝水平的影響 與正常對照組相比，中劑量和高劑量組大鼠血清TG、TC和LDL含量顯著升高(P＜0.05)，HDL含量顯著降低(P＜0.05)。與中劑量組相比，高劑量組大鼠血清 TG、TC和 LDL含量顯著升高(P＜0.05)，HDL含量顯著降低(P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠脂代謝水平比較(n=10，±s，mmol/L)

表2 各組大鼠脂代謝水平比較(n=10，±s，mmol/L)

與正常對照組比較:1)P＜0.05;與中劑量組比較:2)P＜0.05

組別TG TC LDL HDL正常對照組 0.32±0.015 0.94±0.071 0.27±0.026 1.07±0.035低劑量組 0.35±0.020 0.90±0.052 0.24±0.031 0.96±0.045中劑量組 0.51±0.0261) 1.11±0.0421) 0.38±0.0221) 0.77±0.0131)高劑量組 0.72±0.0231)2)1.36±0.0551)2)0.49±0.0311)2)0.63±0.0671)2)

2.4 氧化樂果對各組大鼠血清MDA水平的影響 與正常對照組〔(456.45±10.23)mmol/L〕相比較，低劑量、中劑量和高劑量組大鼠 MDA水平〔(523.5±15.3)、(553.4±12.4)、(614.6±9.99)mmol/L〕顯著升高(P＜0.05)，高劑量組大鼠MDA水平顯著高于低劑量和中劑量組(P＜0.05)。

3 討論

氧化樂果是一種脂溶性分子，其可以很容易通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，一旦進(jìn)入可導(dǎo)致各種組織細(xì)胞的高度損傷。研究表明，氧化樂果可顯著引起脂質(zhì)過氧化，增強(qiáng)ROS的生成〔8〕。ROS主要攻擊生物分子，而脂質(zhì)對ROS的攻擊最為敏感〔9〕，膜脂的過氧化是組織損傷中一個不可避免的過程，而這有可能損害抗氧化的防御系統(tǒng)，導(dǎo)致氧化與抗氧化平衡的改變〔10〕。眾所周知，ROS會導(dǎo)致細(xì)胞毒性〔11〕。而這一現(xiàn)象可通過觀察脂質(zhì)過氧化反映出來〔12〕。MDA是脂質(zhì)過氧化過程中不飽和脂肪酸的分解產(chǎn)物，對MDA的測定可以明確反映脂質(zhì)過氧化的程度〔13〕?？寡趸甘钦{(diào)節(jié)機(jī)體ROS大量產(chǎn)生的重要酶類，在機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激的過程中，第一個關(guān)鍵酶是SOD，SOD可催化超氧陰離子(·)與H+的反應(yīng)，使其轉(zhuǎn)化為過氧化氫(H2O2)〔14〕;第二個關(guān)鍵酶 CAT催化 H2O2分解為 H2O和，同時(shí) GSH-Px 也參與到分解 H2O2的反應(yīng)中〔16〕，GSH-Px可以促進(jìn)H2O2與GSH反應(yīng)，生成H2O及GSSG，尤其在較低濃度的 H2O2下〔17〕，GSH-Px是抗氧化應(yīng)激的核心〔18〕。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)長期接觸氧化樂果能夠?qū)е聶C(jī)體發(fā)生脂質(zhì)過氧化，并且機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)被破壞，主要表現(xiàn)在 SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化物酶活性降低。有研究表明有機(jī)磷農(nóng)藥馬拉硫磷暴露的大鼠血脂異常，HDL水平降低，LDL水平增高〔19〕。

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