李小芳，馮小強(qiáng)*，楊 聲，王廷璞

1天水師范學(xué)院 生化學(xué)院，天水 741001;2定西師范高等?？茖W(xué)校，定西 743000

血清白蛋白可以與許多內(nèi)源和外源性化合物結(jié)合，藥物要通過血漿的儲(chǔ)運(yùn)，才能到達(dá)受體部位產(chǎn)生藥效。因此，研究藥物分子與蛋白質(zhì)間的相互作用具有重要的理論及實(shí)際意義［1，2］。殼聚糖作為一種天然的聚陽離子多糖，具有多種獨(dú)特的生物活性和功能，如活化淋巴細(xì)胞、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗菌抑菌［3，4］、止血［5］、降低血酯和膽固醇以及抗腫瘤［6］等生物活性。在前期工作中，筆者利用殼聚糖分子結(jié)構(gòu)的特性，制備了羧甲基化殼聚糖季銨鹽(CMCQA)，發(fā)現(xiàn) CMCQA 對(duì)常見細(xì)菌 St.aureus、E.coli和真菌A.niger具有很好的抑制作用，且對(duì)E.coli和St.aureus的最小抑菌濃度值較殼聚糖降低了 5倍［7］，CMCQA有望在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有更為廣泛的應(yīng)用。有關(guān)CMCQA與BSA之間相互作用的研究，目前尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用光譜法研究了CMCQA與BSA的作用機(jī)理，該研究為生命科學(xué)研究提供有用的信息。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

CMCQA(制備方法參見文獻(xiàn)［7］，羧甲基取代度為0.62，季銨鹽取代度為0.54);BSA(北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司)，配成濃度為10-5mol/L的溶液，在4℃下保存?zhèn)溆?0.05 mol/L的 Tris-HCl(pH=7.2)緩沖溶液，用 0.01 mol/L NaCl溶液配制。RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)(日本島津公司)。

1.2 CMCQA與BSA的作用

在10 mL容量瓶中均加入BSA溶液2.0 mL，然后加入不同濃度的CMCQA溶液，以Tris-HCl定容，作用1 h。以280 nm為激發(fā)波長，設(shè)定激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為3 nm，記錄280～700 nm范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜。樣品池為1 cm ×1 cm石英吸收池。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜

BSA是內(nèi)源性熒光物質(zhì)，其分子中的色氨酸、酪氨酸殘基均能發(fā)射熒光。在大多數(shù)情況下，認(rèn)為蛋白質(zhì)的熒光主要來自色氨酸殘基的貢獻(xiàn)，而且含色氨酸殘基的蛋白質(zhì)的天然熒光及其變化直接反映了蛋白質(zhì)中色氨酸殘基本身及其周圍環(huán)境的變化［8］。從圖1結(jié)果可以看出，隨著CMCQA濃度的增加，BSA的內(nèi)源熒光強(qiáng)度有規(guī)律地降低，說明CMCQA對(duì)BSA的熒光具有猝滅作用，CMCQA與BSA之間發(fā)生了相互作用。

圖1 CMCQA對(duì)BSA作用的熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra of BSA interacted with different concentrations of CMCQA

2.2 對(duì)BSA熒光猝滅方式的確定

表1為不同溫度下CMCQA對(duì)BSA熒光猝滅的Stern-Volmer方程與猝滅常數(shù)。CMCQA對(duì)BSA的猝滅常數(shù)均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于200 L/mol，各類猝滅劑對(duì)生物大分子的kq最大值為2.0×1010L·mol-1·s-1［9］，可以初步判斷CMCQA對(duì)BSA的熒光猝滅屬于生成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅。另外，動(dòng)態(tài)與靜態(tài)猝滅也可依據(jù)不同溫度下的猝滅常數(shù)得以區(qū)別。對(duì)動(dòng)態(tài)猝滅，溫度升高將有利于熒光體和熒光猝滅劑分子之間的有效碰撞，并可以促進(jìn)電子的轉(zhuǎn)移過程，Ksv隨溫度的升高而增大;若是靜態(tài)猝滅，溫度升高，產(chǎn)物的穩(wěn)定性降低，靜態(tài)猝滅常數(shù)Ksv減?。?0］。在該研究體系中，CMCQA對(duì)BSA的熒光猝滅常數(shù)隨溫度的升高而減小，進(jìn)一步表明CMCQA對(duì)BSA的熒光猝滅作用不是由擴(kuò)散和碰撞引起的動(dòng)態(tài)猝滅，而是生成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅［11］。

表1 不同溫度下CMCQA對(duì)BSA熒光猝滅的Stern-Volmer方程與猝滅常數(shù)Table 1 Stern-Volmer equations and quenching constants of BSA fluorescence quenching with CMCQA at different temperatures

2.3 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

在CMCQA對(duì)BSA的熒光靜態(tài)猝滅過程中，假設(shè)生物大分子BSA有n個(gè)相同且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，可與猝滅劑 CMCQA(稱為 Q)結(jié)合常數(shù)為 kA，則BSA與猝滅劑Q的配合反應(yīng)可表示為:

當(dāng)Q的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于BSA濃度時(shí)，熒光體系的熒光強(qiáng)度和Q的濃度滿足以下關(guān)系:

根據(jù)方程(2)，lg(F0– F)/F～lgC(Q)曲線擬合可得到方程、平衡常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)見表2所示。在室溫下，CMCQA與BSA的的結(jié)合常數(shù)KA為2.45×104L/mol，CMCQA與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)等于1.04，考慮實(shí)驗(yàn)誤差，認(rèn)為一個(gè)CMCQA分子能與一個(gè)BSA分子結(jié)合形成配合物。結(jié)合常數(shù)隨溫度升高而減小，是因?yàn)楫?dāng)溫度升高，有利于結(jié)合產(chǎn)物的解離，使得平衡常數(shù)減小。

表2 不同溫度下CMCQA對(duì)BSA熒光猝滅對(duì)數(shù)方程及其參數(shù)Table 2 Logarithm equations and parameters of BSA fluorescence quenching with CMCQA at room temperatures

2.4 作用力類型的判定

以不同溫度下lnKA對(duì)1/T作圖，得到直線y=7.33+823.16 x(r=0.98833)，根據(jù)直線的斜率可以求出ΔH為-6.844 kJ/mol。同樣，根據(jù)熱力學(xué)公式［12］，求得CMCQA與BSA反應(yīng)的有關(guān)熱力學(xué)參數(shù)(見表3)。因此，可認(rèn)為CMCQA與BSA之間主要是通過靜電引力相互作用。反應(yīng)的ΔH ＜0，表明反應(yīng)為放熱反應(yīng)，升高溫度將不利于向生成復(fù)合物的方向進(jìn)行，所以升高溫度致使靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)減小，生成復(fù)合物的穩(wěn)定性下降，進(jìn)一步說明CMC-QA對(duì)BSA的猝滅是形成復(fù)合物導(dǎo)致靜態(tài)猝滅的過程。

表3 CMCQA與BSA結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Themodynamic parameters of the interaction between CMCQA and BSA

3 結(jié)論

CMCQA與BSA之間通過靜電引力相互作用，對(duì)BSA的猝滅過程為靜態(tài)猝滅。在室溫下，CMCQA與BSA的結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n分別為2.45×104L/mol和1.04。說明CMCQA對(duì)白蛋白的構(gòu)象和分子能級(jí)都有明顯作用，很可能CMCQA是一類具有明顯的抗菌、抗病毒等活性的藥物。

1 Xu Y(徐巖)，Huang HG(黃漢國)，Shen HX(沈含熙).Fluorescence quenching behavior of human serum albumin by quinolone antibacterials.Chin J Anal Chem(分析化學(xué))，1998，26:1494-1497.

2 Feng XZ(馮喜增)，Jin RX(金瑞樣)，Qu Y(曲蕓)，et al.Studies on the ions'effect on the binding interaction between HP and BSA.Chem J Chin Univ(高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào))，1996，17:866-869.

3 Li B，Wang X，Chen RX，et al.Antibacterial activity of chitosan solution against Xanthomonas pathogenic bacteria isolated from Euphorbia pulcherrima.Carbohydr Polym，2008，72:287-292.

4 Chung YC，Chen CY.Antibacterial characteristics and activity of acid-soluble chitosan，Bioresour Technol，2008，99:2806-2814.

5 Xie W，Xu P，Liu Q.Antioxidant activity of water-soluble chitosan derivatives.Bioorg Med Chem Lett，2001，11:1699-1701.

6 Suzuki K，Mikami T，Okawa Y，et al.Antitumor effect of hexa-N-acetylchitohexaose and chitohexaose.Carbohydr Polym，1986，151:403-408.

7 Li XF(李小芳)，F(xiàn)eng XQ(馮小強(qiáng))，Yang S(楊聲)，et al.Preparation and antibacterial activity of water-soluble o-carboxymethyl chitosan quaternary ammonium salt，F(xiàn)ood Sci(食品科學(xué))，2011，32(9):79-81.

8 Liu Y(劉媛)，Xie MX(謝孟峽)，Kang J(康娟).Influence of total saponins of Panax notoginseng on the conformation of BSA.Acta Chim Sin(化學(xué)學(xué)報(bào))，2003，61:1305-1310.

9 Xie MX(謝孟峽)，Xu XY(徐曉云)，Wang YD(王英典)，et al.Spectroscopic investigation of the interaction between 2，3-dihydro-4'，5，7-trihydroxyflavone and human serum albumin.Acta Chim Sin(化學(xué)學(xué)報(bào))，2005，63:2055-2062.

10 Chen GZ(陳國珍)，Huang XZ(黃賢智)，Zheng ZX(鄭朱梓)，et al.Fluorescence Analytical Method(熒光分析方法).Beijing:Science Press，1990.122.

11 Li GZ(李桂芝)，Liu YM(劉永明)，Guo XY(虢新運(yùn))，et al.Study on the interaction between bovine serum albumins and topotecan hydrochloride or irinotecan hydrochloride，Acta Chim Sin(化學(xué)學(xué)報(bào))，2006，64:679-685.

12 Shao S(邵爽)，Ma BY(馬博英)，Wang XJ(王學(xué)杰)，et al.Study on the interaction between cefodizime sodium and bovine serum albumin.Acta Physico-chimica Sin(物理化學(xué)學(xué)報(bào))，2005，21:792-795.