陳福欣，龔 頻，王 靜，馬養(yǎng)民*，周安寧

1西安科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，西安 710054;2教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西科技大學(xué)，生命與工程學(xué)院，化學(xué)與化工學(xué)院，西安 710021

重金屬鎘是一種分布廣泛、毒性持久的環(huán)境污染物。極低劑量的鎘中毒就能誘導(dǎo)心血管疾病的發(fā)生［1，2］，有研究發(fā)現(xiàn)其毒性與氧化應(yīng)激有關(guān);但其毒性作用機(jī)制尚未明確。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，咖啡酸苯乙酯(CAPE)對鎘誘導(dǎo)的心臟損傷具有保護(hù)作用［3］，可能與其抗氧化作用有關(guān)。但目前通過直觀的組織形態(tài)學(xué)觀察證實(shí)鎘對心臟的損傷以及CAPE的保護(hù)作用鮮見報(bào)道。本研究利用光鏡技術(shù)觀察了鎘對小鼠心臟的損傷作用及CAPE對心臟損傷的保護(hù)作用，并探討了CAPE的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性昆明小鼠30只，鼠齡1個(gè)月左右，20 g左右，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，自由取食飲水。CAPE合成于本實(shí)驗(yàn)室，其化學(xué)結(jié)構(gòu)通過1H-NMR(Burker，400 MHz)和質(zhì)譜(Mariner 5074，F(xiàn)ramingham，MA，USA)驗(yàn)證，純度經(jīng)高效液相色譜分析達(dá)98%。氯化鎘(CdCl2)購自天津市福晨化學(xué)試劑廠，生理鹽水購自西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司，蘇木精、曙紅、N-(1-萘基)-乙二胺、對氨基苯磺酸購自瑞士阿達(dá)瑪斯公司，其他試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組和模型構(gòu)建

隨機(jī)將小鼠分成5組、每組6只，空白組(A組):腹腔注射生理鹽水0.2 mL;鎘損傷組(B組):腹腔注射 CdCl2水溶液1 mg/(kg·d);低劑量CAPE保護(hù)組(C組):分別腹腔注射CdCl21 mg/(kg·d)和 CAPE 0.1 μM/(kg·d);中劑量 CAPE 保護(hù)組(D組):分別腹腔注射CdCl21 mg/(kg·d)和CAPE 1 μM/(kg·d);高劑量CAPE保護(hù)組(E組):分別腹腔注射CdCl21 mg/(kg·d)和CAPE 10 μM/(kg·d)。每天給藥1次，持續(xù)給藥7 d。根據(jù)小鼠心肌脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度來判斷模型是否構(gòu)建成功［3］。

1.2.2 組織形態(tài)學(xué)切片的制作

最后1次注藥24 h后，斷頸處死小鼠，取新鮮心臟組織保存在10%的福爾馬林中，梯度脫水，包埋于石蠟，制作厚度為5 μm的切片，蘇木精—曙紅染色，400×光鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 NO 的含量測定

取新鮮心臟組織，用預(yù)冷的磷酸緩沖液(pH 7.4)勻漿，100 μL 樣品加入等體積的 0.1%N-(1-萘基)-乙二胺、1%對氨基苯磺酸，利用Griess反應(yīng)來測定心臟組織中NO的含量。原理:堿性環(huán)境下，溶液中的NO-2可與對氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)，再與N-(1-萘基)-乙二胺偶聯(lián)，生成紫紅色產(chǎn)物，測量其在540 nm下的吸光值，由測定的NO-2含量間接的反映NO的含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 CAPE的金屬螯合能力檢測

CAPE與二價(jià)鐵離子的螯合實(shí)驗(yàn)按照Gong等［4］的方法進(jìn)行。不同體積、濃度為1 mg/mL的CAPE加入到1 mmol/L的(NH4)2Fe(SO4)2(溶于NaAc-HAc緩沖液，pH 5.0)溶液中，通過加入 4 mmol/L的鄰菲羅啉(溶于 NaAc-HAc緩沖液，pH 5.0)來起始反應(yīng)，反復(fù)振蕩混合物，室溫下靜置10 min。當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡后，于510 nm檢測吸收值。重復(fù)3次，取均值。Fe2+-鄰菲羅啉一水化物復(fù)合體形成的抑制百分比=(1－A1/A0)×100%。其中A0是空白的吸收值，A1是含有CAPE樣品的吸收值。空白中不含有 1，10-鄰菲羅啉一水化物及(NH4)2Fe(SO4)2。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞的組織學(xué)形態(tài)

組織形態(tài)學(xué)研究表明，空白組心肌細(xì)胞排列整齊，無炎癥細(xì)胞侵潤;損傷組中，鎘毒性能夠引起心肌細(xì)胞小灶狀壞死，產(chǎn)生空泡及炎癥細(xì)胞的侵潤，此外，觀察到心肌細(xì)胞腫脹;然而在CAPE保護(hù)組，C組中，仍有心肌細(xì)胞壞死及大量的空泡結(jié)構(gòu)，而D組空泡形成減少、心肌細(xì)胞基本正常，E組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，無炎癥細(xì)胞的侵潤等，結(jié)果表明鎘對心臟的毒性損傷及CAPE的保護(hù)作用。

圖1 鎘對心臟NO含量的影響以及CAPE的保護(hù)作用Fig.1 The influence of cadmium on cardiac NO content and the protective effect of CAPE

圖2 不同濃度CAPE的金屬螯合能力Fig.2 Metal chelating capacities of different concentrations of CAPE

2.2 各組NO含量及CAPE的金屬螯合能力比較

通過測定鎘損傷組及CAPE保護(hù)組NO含量，發(fā)現(xiàn)鎘毒性能夠降低NO水平，為正常組的87.1%(P ＜0.05)，而CAPE的保護(hù)作用能夠抑制NO的減低(P ＜ 0.05)(圖1)。

如圖2所示，CAPE的金屬螯合數(shù)據(jù)表明CAPE可以呈濃度依賴螯合Fe2+，具有金屬螯合作用。

3 討論

鎘致心臟損傷的發(fā)病機(jī)制與其影響因素有關(guān)。研究表明鎘毒性作用能夠誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)(Lipid Peroxidation，LPO)的增加;鎘還能夠通過減少一氧化氮(NO)的釋放誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷［5］;此外，炎癥反應(yīng)也是心臟損傷的關(guān)鍵誘因［6］。

CAPE是中藥蜂膠的主要活性成分，具有廣泛的生理藥理活性，包括抗氧化、抗病毒、抗動(dòng)脈硬化、抗菌、抗炎、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和提高機(jī)體免疫力等［7］。我們之前的研究顯示，CAPE對鎘致心臟損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與CAPE的抗氧化作用有關(guān)。本研究從組織病理學(xué)角度觀察了鎘致心臟損傷形態(tài)學(xué)的改變及CAPE的保護(hù)作用。空白組心肌細(xì)胞排列整齊，無炎癥浸潤;損傷組產(chǎn)生空泡，心肌細(xì)胞發(fā)生腫脹;而CAPE能夠明顯抑制鎘對心肌細(xì)胞造成的損傷。說明鎘毒性能夠?qū)π募〖?xì)胞造成損傷，破壞正常的細(xì)胞形態(tài)，影響功能，然而CAPE的保護(hù)作用能夠緩解損傷，減少鎘的毒害，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［8］。

NO可能是自由基毒性的保護(hù)因子，氧自由基通過下調(diào)NO的合成，從而損傷心臟功能，因此鎘的心臟毒性可能與心臟組織中NO含量的減少有關(guān)。CAPE能夠提高心臟組織中NO的含量，可能的途徑有直接增加NOS的活性、激活某些酶協(xié)同因子的產(chǎn)生或通過清除自由基，阻止自由基對NO產(chǎn)生的抑制作用［9］。通過測量NO的含量，從另一方面探討了CAPE對鎘誘導(dǎo)心臟損傷的保護(hù)機(jī)理。

鎘致心臟損傷的毒性機(jī)制還可能和鎘與生物大分子的結(jié)合有關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)鍵酶的失活或者引起DNA鏈的斷裂，形成惡性循環(huán)［3］。CAPE呈濃度依賴的螯合Fe2+，證明CAPE具有較強(qiáng)的金屬螯合能力。因此，CAPE能夠保護(hù)心臟免受鎘損傷可能是通過螯合體內(nèi)游離的鎘離子，減弱鎘對生物大分子的損傷，起到類似于金屬硫蛋白的作用。CAPE的金屬螯合能力主要與其分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。CAPE雙鍵共軛的苯環(huán)上3，4位各有一個(gè)酚羥基，相鄰的酚羥基能以氧負(fù)離子的形式與金屬離子形成穩(wěn)定的五元環(huán)螯合物，從而發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)［10］。本研究從另一方面闡明了CAPE對鎘致心臟損傷的保護(hù)機(jī)理，也為重金屬的解毒提供了新思路，對CAPE藥物開發(fā)提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，鎘通過抑制NO的釋放，改變小鼠心肌細(xì)胞的正常形態(tài)，損傷其正常機(jī)能;CAPE對鎘致心臟損傷的保護(hù)途徑可能是通過螯合金屬離子，減弱其對生物大分子的損傷，起到類似于金屬硫蛋白的作用。

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