侯麗 施燕平 山東省醫(yī)療器械產品質量檢驗中心；山東省醫(yī)療器械生物學評價重點實驗室 （濟南 250101)

0.引言

GB/T 16886系列標準是我國醫(yī)療器械生物學評價與檢驗的主要依據(jù)。一直以來， 如何正確理解實施GB/T 16886系列標準是醫(yī)療器械生物學評價與檢驗人員和醫(yī)療器械生產商所共同關注的問題。 尤其近幾年陸續(xù)有標準進行版本更新，為使業(yè)內人士對新版標準中變動部分較快理解和應用，本文從實際應用的角度，根據(jù)2012年4月在美國圣地亞哥召開的國際標準化組織醫(yī)療器械生物學評價標委會(ISO/TC194)第23屆年會中WG7（Systemic toxicity）工作組的會議內容，結合工作經(jīng)驗對剛剛發(fā)布的GB/T 16886.11-2011（ISO10993-11:2007）部分中較為關注的重復接觸全身毒性試驗進行了解讀，并針對標準實施中存在的誤區(qū)和產生的問題進行了研究并展開討論，以便更好地貫徹實施GB/T 16886.11標準。

與GB/T16886.11-1997不同，GB/T 16886.11-2011全面修改了全身毒性試驗，給出了總則、試驗設計、評價指標和最終報告的要求。全身毒性試驗包括急性全身毒性試驗和重復接觸全身毒性試驗，后者又可分為亞急性、亞慢性和慢性全身毒性試驗。急性毒性與一次劑量（或限制性接觸）的不良作用有關，而許多醫(yī)療器械更常見的人體接觸方式是重復或持續(xù)接觸形式。重復或持續(xù)接觸可能會由于化學物在組織內的積聚或其他機制產生反應，長期試驗（亞急性、亞慢性、慢性）對于鑒別此類作用是非常重要的。由于慢性全身毒性試驗一般是亞慢性試驗在時間上的再延長，根據(jù)人體接觸周期來確定， 記錄和報告的很多參數(shù)是相同的，因此本文以亞急性、亞慢性毒性試驗為例，對不同因素分別進行介紹。

1.試驗選擇

表1. 要考慮的評價試驗（亞慢性毒性(亞急性毒性)）

按照GB/T 16886.11-2011的要求，與黏膜、損傷表面持久接觸的表面器械，與血路間接持久接觸、與組織骨牙本質、循環(huán)血液長期及持久接觸的外部接入器械，與組織骨、血液長期及持久接觸的植入器械可能要進行亞慢性亞急性毒性試驗。由于標準中將亞慢性和亞急性毒性試驗放在一起進行論述，因此如何選擇亞慢性和亞急性毒性試驗是企業(yè)標準制定中面臨的問題。無論選擇哪種試驗，臨床累積接觸的最長時間應該能覆蓋動物的受試物接觸時間。表1是GB/T16886.1-2011中考慮要進行亞慢性毒性(亞急性毒性)的器械類型。

2. 接觸時間的選擇

GB/T 16886.11-2011中關于重復接觸全身毒性試驗的定義如下：

亞急性全身毒性：在24h～28d內多次或持續(xù)接觸試驗樣品后發(fā)生的不良作用。時間周期大多選擇14d～28d，并考慮合理的方法。其中，亞急性靜脈研究一般規(guī)定接觸時間 >24h，但< 14d。

亞慢性全身毒性：反復或持續(xù)接觸試驗樣品后在動物壽命期的某一階段發(fā)生的不良作用。其中，非靜脈接觸途徑下，嚙齒動物亞慢性毒性研究一般為90d，其他種屬動物在不超過其壽命期的10%的階段內。靜脈研究一般規(guī)定接觸時間為14d～28d。

表2. 嚙齒類和非嚙齒類動物的接觸周期

慢性全身毒性：在動物的主要壽命期內反復或持續(xù)接觸試驗樣品后發(fā)生的不良作用。接觸時間一般為6～12個月。

從以上定義中可以看出根據(jù)選擇的動物種類、接觸途徑不同，不同類型的毒性研究的接觸時間也不盡相同。但是以上定義未對其不同給出具體的時間選擇。目前在我國進行的試驗中（以亞慢性毒性試驗為例），一般選用嚙齒類動物進行試驗，接觸方式為靜脈注射的試驗周期為14～28天不等，為評價帶來了難度。在2012年舉辦的ISO/TC194年會上，WG7工作組專家對以上定義提出了將嚙齒類和非嚙齒類動物的靜脈接觸方式的周期分開，見表2 。

3.接觸途徑

GB/T 16886.11-2011中規(guī)定，醫(yī)療器械或其可瀝濾物可通過多種接觸途徑進入人體，亞慢性（亞急性）全身毒性試驗最好采用具有臨床相關性的接觸途徑，如采用其他接觸途徑應予以論證。選擇接觸途徑時考慮下列因素：（1）人體實際接觸途徑和作用時間；（2）醫(yī)療器械的理化性質和用途；（3）毒性試驗目的。

附錄A中提到的接觸方式有皮膚、植入、吸入、皮內、肌內、腹腔、靜脈、經(jīng)口、皮下等。ISO 10993-1:2003推薦擴展植入試驗方案， 在植入試驗中同時進行全身毒性方面的評價， 特別適用于植入類器械。值得注意的是經(jīng)腹腔途徑的全身毒性試驗適用于液路器械，或腹腔接觸環(huán)境導致化學物溶出的器械，也適用于不宜經(jīng)靜脈途徑的浸提液，如非極性油浸提液以及含有微粒的浸提液。腹腔途徑優(yōu)于試驗樣品過濾后靜脈注射。

關于浸提介質的選擇，標準規(guī)定最好選用極性和非極性兩種介質。但選用非極性油介質時，需考慮油性介質重復性給藥對動物生理指標的影響，因此ISO/TC194工作組推薦將極性介質（NS）和非極性介質（如芝麻油）應用在同一只動物體內（同一動物雙重途徑給藥法，“duel routes of administration - same animal” model），即 iv 每天給藥一次，ip3～4天給藥一次。

目前進行該試驗時，較為困難的是根據(jù)產品特點和臨床接觸方式選擇不同的接觸劑量和接觸途徑。但這并不意味著動物的接觸方式就一定要和臨床人體接觸條件完全一致，大部分毒性試驗的設計是基于臨床應用，由于臨床應用是針對人體設計而成的，在用于醫(yī)療器械的檢驗時不宜完全照搬，而是要根據(jù)器械具體特性進行適當?shù)男薷?，使之能反映器械的毒性大小。WG7工作組組長Dr. Daniel McLain認為和組織接觸的器械也可以以植入的方式接觸動物，如引流系統(tǒng)、可吸收性止血紗布、透明質酸凝膠、體外循環(huán)管路等。

4.接觸劑量

4.1 劑量組大小

試驗周期越長，實驗組的動物數(shù)量就越多，這樣在試驗終結時保證每組能有足夠的動物進行有效的生物學評價。但是，基于GB/T 16886.2-2011中動物福利的要求，采用最少的動物來獲取有效結果。GB/T 16886.11-2011給出了推薦的各接觸途徑的最少動物數(shù)量（見表3）。驗組動物完全一致。由于醫(yī)療器械重復接觸全身毒性試驗與經(jīng)典的化學物毒性試驗不同，通常不會產生劑量反應作用，這樣在最高劑量水平不一定產生毒性作用。采用一種適宜的試驗樣品劑量進行單劑量組試驗可判定是否存在毒性危害（即限度試驗），但其他多劑量或劑量反應試驗要求多

4.2 劑量組數(shù)

GB/T 16886.11-2011規(guī)定，對于較長期試驗，宜包括至少三種劑量水平和適當?shù)膶φ战M。對照組動物除了不接觸試驗物質，其他處置方式與試個劑量組來判定毒性反應。試驗所采用的劑量范圍將會提供有效的人體安全應用界限評估。其中，慢性全身毒性試驗可在亞慢性毒性試驗的基礎上增加劑量組，包括衛(wèi)星劑量組。

表3. 推薦的劑量組最少動物數(shù)量

如準備采用加嚴劑量，可增加劑量組。劑量加嚴時可考慮下列參數(shù)：臨床接觸表面積的倍數(shù)；接觸周期的倍數(shù)；浸提分數(shù)或具體化學物的倍數(shù)；24 h接觸期的倍數(shù)等。

4.3 劑量頻率

劑量頻率應具有臨床相關性，在重復接觸試驗中，試驗周期內動物最好每周7日接觸試驗樣品，也可采用其接觸方式（如較長期重復接觸試驗每周5日接觸），但應進行論證。

4.4 劑量體積

GB/T 16886.11-2011中附錄B規(guī)定試驗樣品接觸最大劑量體積，但不應做為常規(guī)接觸劑量的選擇。以靜脈給藥為例，大鼠40ml/kg一般為靜脈滴注的形式，給藥時間越快，就越應注意給藥速度對實驗動物循環(huán)系統(tǒng)的影響（比如采用靜推的方式可以適當降低劑量體積）。

5.結果評價

亞慢性毒性(亞急性毒性)試驗是一個綜合性試驗，評價內容包括體重和飼料/水消耗、臨床觀察、臨床病理學（包括采用血液學和臨床生化分析來研究組織、器官和其他系統(tǒng)的毒性反應）、大體病理學、器官稱重、組織病理學等。這并非要求每個試驗的所有觀察指標都毫無例外地進行檢測。各種試驗可根據(jù)器械或其浸提液的具體情況選做部分指標。原則是選擇能反映試驗動物的一般機體狀況，能反映器械或其浸提液作用特性、靶器官功能損傷的指標。選取的指標應盡可能全面，但又不因檢查過多使動物受到額外的損傷。此外，還可根據(jù)預試驗中動物的中毒表現(xiàn)，結合醫(yī)療器械、或其浸提液的理化特點選擇增加某些特征性指標。觀察次數(shù)和間隔時間可根據(jù)毒性反應的性質和嚴重程度、反應速度和恢復周期來確定，在試驗的早期階段尤其在急性試驗中，可能需要增加觀察次數(shù)。毒性跡象出現(xiàn)和消失的時間、持續(xù)時間和動物死亡時間都是很重要的，特別是出現(xiàn)不良反應跡象或延遲性死亡的現(xiàn)象，這種情況下可采用人道方法處死動物以避免使動物遭受不必要的痛苦。表4給出了各類型試驗至少應觀察的項目。

表4. 觀察項目

應當注意的是，本文中的表4和GB/T 16886.11-2011中表2略有不同，標準提及的觀察項目中亞慢性和慢性毒性指標放在一起，與標準正文的觀點不一致。為使評價指標表達更清楚，ISO/TC194WG7工作組專家一致決定將亞慢性和亞急性毒性放在一起，并去掉本列觀察項目里的腳注。

但是，由于不同實驗室的理解和操作規(guī)程不同，有些實驗室可能會選擇不同的指標參數(shù)，比如GB/T 16886.11-2011附錄D規(guī)定了建議的血液學、臨床生化和尿液測定法，附錄E規(guī)定了建議進行組織病理學評價的器官。但是由于選擇的指標不統(tǒng)一造成評價方法不同，給毒性結果的客觀性產生一定的影響。為此，ISO/TC194工作組制定了“亞急/亞慢毒性試驗哺乳動物組織病理學分層法（tiered histopathology approach” for subacute/subchronic studies）”的方案。在本方案中，列出了需要觀察的器官系統(tǒng)為循環(huán)、消化、內分泌、泌尿、免疫、肌肉、神經(jīng)、生殖、呼吸和骨骼系統(tǒng)，每個系統(tǒng)按層（tier）選擇一定的指標進行分析，即可先進行第一層（tier 1）的研究，若各項參數(shù)均正常則可停止下一步的測試，否則需要根據(jù)異常指標選擇相關的其他指標進行驗證性研究（第二層），或者選擇全部指標進行測試以排除其他系統(tǒng)的問題（第三層）。值得注意的是，如何判斷第一層（甚至第二層或全部）指標是否“正常（normal）”？即使排除測定前影響指標的諸多因素，可能仍會出現(xiàn)一些觀察指標與陰性對照相比產生統(tǒng)計學意義。這時應將臨床病理學、組織病理學、樣品性質、接觸方式和劑量等，結合以前的研究發(fā)現(xiàn)綜合分析得出是否具有“生物學相關性”的判定后決定是否進行進一步的試驗，這就要求檢測和評價人員具有豐富的病理學經(jīng)驗和對產品、試驗方法充分的理解。目前醫(yī)療器械產品種類復雜，重復接觸全身毒性試驗測試樣品的接觸方式、劑量、時間等有各種不同的觀點，為重復接觸長期毒性的評價帶來了一定的難度。應注意此類試驗的局限性，對結果進行科學的判斷。

綜上所述，醫(yī)療器械的重復接觸毒性試驗的評價方法可能還不夠成熟，但隨著產品種類的增多會積累更多的經(jīng)驗，這就需要評價、檢測人員和生產企業(yè)各方共同做出努力。

[1]GB/T16886.1-2011， 醫(yī)療器械生物學評價第1部分：評價與試驗[S].

[2]GB/T16886.2-2011，醫(yī)療器械生物學評價第11部分：動物福利要求[S].

[3]GB/T16886.11-2011，醫(yī)療器械生物學評價第11部分：全身毒性試驗[S].