馬 微 李 麗 楊永旭 葛堂棟 樸金花 張鵬霞

(牡丹江醫(yī)學(xué)院研究生處，黑龍江 牡丹江 157011)

細(xì)胞癌變的本質(zhì)是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路失調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞無限增殖〔1〕。伊馬替尼等藥物對慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)治療獲得的成功證明了靶向治療白血病是重要的發(fā)展方向〔2，3〕。Caveolin-1(CAV1)是caveolae的主要結(jié)構(gòu)蛋白，位于信號通路交聯(lián)中心，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。CAV1基因的突變?nèi)笔?、啟動子區(qū)域CpG島位點(diǎn)的高密度甲基化〔4〕、CAV1-α亞型中Y14磷酸化的異?！?〕、上游轉(zhuǎn)錄因子及信號蛋白的異常啟動激活CAV1或上調(diào)其表達(dá)量均可引起腫瘤的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)選取具有代表性的五種白血病細(xì)胞株，從基因、蛋白水平檢測CAV1的表達(dá)，探討CAV1在白血病中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 Reverse Transcriptase M-MLV、SYBR Premix Ex Taq購于 TaKaRa公司，Trizol試劑購于 Invitrogen公司，M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent試劑盒、蛋白定量試劑盒Pierce BCA Protein Assay Kit、化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑盒購于Pierce公司，聚氟偏乙烯(PVDF)膜購于MILLIPORE公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與收集 SUP-B15、HL-60、THP-1、K562白血病細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，人慢性淋巴細(xì)胞白血病原代腫瘤細(xì)胞采用磁珠分選分離收集，人正常白細(xì)胞(WBC)由本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)分離收集。

SUP-B15、HL-60、THP-1、K562 細(xì)胞常規(guī)懸浮培養(yǎng)，使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱，每2～3 d傳代1次。1 000 r/min離心收集細(xì)胞沉淀。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA的制備 離心收集洗滌細(xì)胞1×107個(gè)，加入1 ml Trizol試劑，反復(fù)吹打后12 000 r/min，4℃離心5 min，將上清移至經(jīng)DEPC水處理過的1.5 ml無菌離心管中進(jìn)行總RNA的抽提。紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系為 RNA/引物變性液10 μl，5×M-MLV 緩沖液4 μl，dNTP Mixture 1 μl，Ribonuclease Inhibitor 1 μl，RTase MMLV 1 μl，RNase free dH2O 加至 20 μl，42℃保溫 1 h，70℃保溫15 min后冰上冷卻。

1.2.3 細(xì)胞總蛋白提取 使用M-PER人蛋白抽提試劑盒，每2×107個(gè)細(xì)胞加入1 ml M-PER試劑，反復(fù)吹打至液體黏稠，4℃ 1 000 r/min離心5 min，收集上清。BCA法測定蛋白濃度，調(diào)整濃度至10 μl，－20℃保存。

1.2.4 CAV1 mRNA表達(dá)水平的熒光實(shí)時(shí)定量PCR(QRTPCR)檢測 引物由上海Invitrogen公司合成，引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件為95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，循環(huán)數(shù)為40。擴(kuò)增體系為Takara SYBR Premix Ex Taq 10 μl，上下游引物各 0.4 μl，cDNA 模板2 μl，加水至總體積為 20 μl。采用用△△Ct方法，以看家基因β-actin mRNA作為對照，通過Ct值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。因在細(xì)胞中擴(kuò)增曲線良好，呈明顯“S”型，反應(yīng)體系擴(kuò)增率正常。引物溶解曲線峰型單一，引物特異性良好，PCR產(chǎn)物單一。與WBC對照細(xì)胞(0.781±0.16)相比，SUP-B15(0.311±0.07)、HL-60(0.097 ± 0.02)、K562(0.127 ± 0.04)、THP-1(0.101±0.02)、CLL細(xì)胞(0.100±0.02)CAVI mRNA表達(dá)均降低。

2.3 CAV1蛋白表達(dá)水平的Western印跡檢測結(jié)果 與對照組相比，在選取的五種白血病細(xì)胞中CAV1蛋白表達(dá)量均降低，且表達(dá)量由低到高依次為 CLL、HL-60、THP-1、K562、SUPB15。見圖2。

表1 引物序列

1.2.5 CAV1蛋白表達(dá)水平的Western印跡檢測 將蛋白樣品進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰酶(SDS-PAGE)凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，常溫封閉2 h Tris鹽酸緩沖液(TBST)沖洗2遍，加入CAV1 一抗(1∶500)或 β-actin一抗(1∶800)4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，10 min/次，加入二抗抗兔(1∶4 000)或抗鼠(1∶6 000)孵育，洗膜、發(fā)光、曝光、顯影、定影，采用灰度掃描軟件TotallLab進(jìn)行膠片灰度掃描，分析檢測結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)資料采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 總RNA濃度及純度檢測結(jié)果 紫外分光光度計(jì)結(jié)果顯示A260/280在1.8～2.0之間，總RNA無明顯基因組DNA污染，無明顯降解。100 V恒壓下1%瓊脂糖凝膠電泳20 min，電泳結(jié)果顯示，28 S和18 S rRNA兩條帶較為清晰，RNA純度較高，無明顯降解。見圖1。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳

2.2 CAV1 mRNA表達(dá)水平的QRT-PCR檢測結(jié)果 CAV1基

圖2 Western印跡檢測CAV1蛋白表達(dá)水平

3 討論

CAV1在腫瘤中的生物學(xué)作用是復(fù)雜的，可影響腫瘤的多藥耐藥〔4～6〕;調(diào)節(jié)細(xì)胞周期〔7〕與信號轉(zhuǎn)導(dǎo);參與調(diào)控衰老過程〔8，9〕;可增強(qiáng)細(xì)胞自噬功能〔10，11〕;參與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移等。CAV1基因在腫瘤中的作用存在著爭議，抑癌基因還是癌基因不可一概而論，在不同的腫瘤細(xì)胞中充當(dāng)著不同的角色。在白血病細(xì)胞中，CVA1因類型不同表達(dá)亦不相同。有研究顯示HTLV-1感染的T細(xì)胞株與未感染的T細(xì)胞株和正常的外周血單個(gè)核細(xì)胞相比，這些細(xì)胞表現(xiàn)出了CAV1的高表達(dá)〔12〕。急性白血病患者中初治時(shí)CVA-1蛋白表達(dá)水平明顯低于正常對照組，誘導(dǎo)化療緩解后表達(dá)水平有所上升，復(fù)發(fā)時(shí)表達(dá)水平再次下降，且可作為療效判斷指標(biāo)〔13〕。國內(nèi)外對CAV1基因與白血病發(fā)生機(jī)制的研究報(bào)道尚且不多，本課題為深入研究CAV1在白血病中的作用提供了必要的前提，具有重要的意義。

1 Huang WL，Zhu XE.Signal Transduction〔M〕.Beijing:People's Medical Publishing House，2005:151-99.

2 Merx K，Müller MC，Kreil S，et al.Early reduction of BCR-ABL mRNA transcript levels predicts cytogenetic response in chronic phase CML patients treated with imatinib after failure of interferon alpha〔J〕.Leukemia，2002;16(9):1579-83.

3 Okada M，Satake A，Kaida K，et al.Successful treatment with nilotinib after imatinib failure in a CML patient with a four-way Ph chromosome translocation and point mutations in BCR/ABL gene〔J〕.Int J Hematol，2011;93(2):243-6.

4 Rao X，Evans J，Chae H，et al.CpG island shore methylation regulates caveolin-1 expression in breast cancer〔J〕.Oncogene，2013;32(38):4519-28.

5 Felicetti F，Parolini I，Bottero L，et al.Caveolin-1 tumor-promoting role in human melanoma〔J〕.Int J Cancer，2009;125(7):14-22.

6 Parton RG.Cell biology.Life without caveolae〔J〕.Science，2001;293(5539):2404-5.

7 Yi JS，Mun DG，Lee H，et al.TRF/cavin-1 is essential for multidrug resistance in cancer cells〔J〕.J Protcome Res，2013;12(2):605-14.

8 Lavie Y，F(xiàn)iucci G，Liscovitch M.Up-regulation of caveolae and caveolar constituents in multidrug-resistant cancer cells〔J〕.J Biol Chem，1998;273(49):32380-3.

9 Fang K，F(xiàn)u W，Beardsley AR，et al.Overexpression of caveolin-1 inhibits endothelial cell proliferation by arresting the cell cycle at G0/G1 phase〔J〕.Cell Cycle，2007;6(2):199-204.

10 Zou H，Stoppani E，Volonte D，et al.Caveolin-1，cellular senescence and age-related diseases〔J〕.Mech Ageing Dev，2011;132(11-12):533-42.

11 Bai L，Deng X，Li J，et al.Regulation of cellular senescence by the essential caveolar component PTRF/Cavin-1〔J〕.Cell Res，2011;21(7):1088-101.

12 Martinez-Outschoorn UE，Whitaker-Menezes D，Lin Z，et al.Cytokine production and inflammation drive autophagy in the tumor microenvironment:role of stromal caveolin-1 as a key regulator〔J〕.Cell Cycle，2011;10(11):1784-93.

13 劉 艷，王 洋，史 丹，等.腫瘤細(xì)胞的自噬和窖蛋白-1〔J〕.生物工程學(xué)報(bào)，2012;28(8):912-7.

14 Sawada S，Ishikawa C，Tanji H，et al.Overexpression of caveolin-1 in adult T-cell leukemia〔J〕.Blood，2010;115(11):2220-30.

15 程榮輝.Caveolin-1蛋白在急性白血病中的表達(dá)及其與bcl-2的相關(guān)性研究〔D〕.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院碩士論文，2009.