潘群雄 蘇子劍 王聰仁 莊建良 (福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院腫瘤外科，福建 泉州 362000)

食管鱗狀細胞癌是我國常見惡性腫瘤之一，盡管近年來在診斷和治療方面均取得了巨大的進步，但其總體療效仍不理想，且對于食管鱗狀細胞癌的發(fā)生、發(fā)展過程及相關分子機制尚不清楚。食管鱗狀細胞癌可能是一種干細胞性疾病。因此腫瘤干細胞學說的提出，為食管鱗狀細胞癌的研究帶來了新的希望。本研究應用免疫組織化學方法檢測干細胞標志EPCAM在食管鱗狀細胞癌組織中的表達，探討可能影響食管鱗狀細胞癌預后的因素，以及EPCAM在食管鱗狀細胞癌癌發(fā)生、發(fā)展中可能的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 病例資料 選取我院1995～2004年間行食管癌根治術(shù)且隨訪資料完整的90例病例，術(shù)前均未進行放、化療及免疫治療，且術(shù)后根據(jù)指南進行相應輔助治療。其生存期從手術(shù)之日起開始計算，終止日期為死亡期或末次隨訪日期，截止日期為2011年1月30日。隨訪期限從24～84個月不等，平均隨訪日期為52.73個月。所有患者的手術(shù)標本經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，分別做HE染色及免疫組化染色。

食管鱗狀細胞癌患者術(shù)前均未行放療或化療，均經(jīng)術(shù)后病理組織學確診，均有完整的臨床病理資料，年齡32～75〔平均 (45±8.5)〕歲，＜60歲65例，≥60歲25例;其中男65例，女25例;高分化20例，中分化52例，低分化18例;TNM分期:Ⅰ+Ⅱ期63例，ⅢA期27例;脈管有瘤栓13例，脈管無瘤栓77例;浸潤至黏膜下層或肌層63例，浸潤至食管纖維膜27例;淋巴結(jié)有癌轉(zhuǎn)移28例，淋巴結(jié)無癌轉(zhuǎn)移62例。

1.2 實驗試劑 鼠抗人EPCAM單克隆抗體購于antibodiesonline。Elivision試劑盒，胃蛋白酶，H2O2，內(nèi)源性生物素阻斷試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.3 實驗過程 采用免疫組化Elivision法染色，嚴格按試劑盒說明方法操作。石蠟切片脫蠟水化，EPCAM采用EDTA抗原修復液，微波加熱使之維持92℃ ～95℃15 min，室溫放置20 min后自然冷切后取出玻片。3%H2O2孵育，生物素阻斷劑阻斷。加入一抗 CD133、EPCAM單克隆抗體，工作濃度為1∶100，二抗孵育，DAB顯色，脫水，透明，封片。用已知的陽性切片作陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判定 兩位病理醫(yī)師獨立觀察，隨機采集10個有代表性的視野計數(shù)，取平均值。CD24陽性染色判斷標準:胞質(zhì)或胞膜有棕黃色顆粒沉著者為陽性染色。依陽性細胞百分率判定陽性強度。陽性細胞數(shù)＜10%為陰性，10%為陽性。

1.5 統(tǒng)計學方法運用SPSS17.0軟件，EPCAM蛋白表達與食管鱗狀細胞癌臨床病理病理學特征采用χ2檢驗;生存分析采用Kaplan-Meier法分析，不同生存曲線的差異性檢驗用對數(shù)秩檢驗;運用多因素COX模型法來綜合評價和權(quán)衡各因素對預后生存的影響。

2 結(jié)果

2.1 EPCAM在食管鱗狀細胞癌組織和癌旁組織中的表達免疫組織化學染色顯示癌旁組織EPCAM少數(shù)呈弱陽性表達，食管鱗狀細胞癌組織CD24明顯表達，陽性定位于細胞膜上，部分細胞細胞質(zhì)亦染色(圖1)，其他位置未見染色。癌組織與癌旁組織CD24陽性表達差異具有顯著性(67.78%vs 21.11%，χ2=11.378，P=0.000)。

圖1 EPCAM在不同組織中的表達(DAB)

2.2 EPCAM與食管鱗狀細胞癌病理參數(shù)的關系 食管鱗狀細胞癌組織EPCAM表達與患者的年齡、性別、病理分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關。浸潤程度較深的癌組織中CD24表達水平明顯高于對應組(P＜0.05)，見表1。

表1 EPCAM陽性表達與食管鱗狀細胞癌病理參數(shù)的關系(n)

2.3 食管鱗狀細胞癌組織中EPCAM蛋白陽性表達與患者生存時間的關系 表2示EPCAM表達強陽性食管鱗狀細胞癌患者生存率明顯低于EPCAM表達強度較低組(χ2=18.730，P=0.000)。

表2 EPCAM表達與食管鱗狀細胞癌總生存率的關系

2.4 COX比例風險模型分析 對可能影響食管鱗狀細胞癌預后的8個相關因素:EPCAM、患者的年齡、性別、組織學分級、浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，有無脈管浸潤，TNM分期，進行多因素COX模型分析，結(jié)果顯示，有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和EPCAM是影響肝癌預后的因素(P＜0.05，表3)。

表3 食管鱗狀細胞癌患者臨床病理特征多因素Cox回歸分析結(jié)果

3 討論

復發(fā)與轉(zhuǎn)移是影響食管鱗狀細胞癌患者預后的根本原因。腫瘤干細胞學說認為腫瘤組織中存在極少量腫瘤細胞，在腫瘤發(fā)展中充當干細胞角色，具有自我更新和無限分化、增殖潛能，在啟動腫瘤形成和生長中起著關鍵性作用，決定腫瘤的形成、復發(fā)和轉(zhuǎn)移;而其余大多數(shù)腫瘤細胞經(jīng)過短暫的分化后最終死亡。人類腫瘤干細胞首次報道給我們帶來了希望〔1〕。

EPCAM表達于人類部分正常上皮細胞和大多數(shù)惡性上皮腫瘤細胞表面。Went等〔2〕用免疫組化法研究了3 347份組織標本，常見腫瘤EPCAM的表達情況:食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌均達到或接近100%;乳腺癌73%，腎癌51.8%，肝細胞癌14.9%，皮膚鱗癌4.7%，肉瘤4.8%;黑色素瘤、神經(jīng)鞘瘤、淋巴瘤等無表達。Du等〔3〕用免疫組織化學染色方法研究發(fā)現(xiàn)，EpCAM在轉(zhuǎn)移性胃癌較非轉(zhuǎn)移性胃癌明顯高表達。Osta等〔4〕用定量RT-PCR檢測乳腺正常組織和癌組織EpCAM-mRNA的表達情況，發(fā)現(xiàn)癌組織表達量是正常組織的100～1 000倍。與正常組織相比，62.5%的舌鱗狀細胞癌明顯過表達EPCAM，過表達EPCAM與腫瘤大小、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高度正相關〔5〕。EPCAM基因中具有rs1126497 CT表型的喉癌細胞具有更強的侵襲能力，并與復發(fā)與進展狀態(tài)相關。在原始視網(wǎng)膜母細胞上觀察到 EPCAM、CD24、ABCG2共表達〔6〕。實驗也證實了EPCAM促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。實驗通過小分子干擾RNA(siRNA)下調(diào)EPCAM的表達，在體外可明顯抑制胃癌、喉癌、舌鱗狀細胞癌腫瘤細胞的黏附、浸潤和遷移，在體內(nèi)可抑制胃癌細胞的轉(zhuǎn)移能力用〔3～5〕。在體外實驗中，與EPCAM陰性細胞相比，EPCAM陽性的細胞具有更強的增殖能力和神經(jīng)球形成能力〔6〕。通過T細胞介導的EPCAM×CD3抗體能明顯使原始視網(wǎng)膜母細胞增殖能力減弱，并使IFN-γ、IL-10、IL-2、TGF-β 等效應性細胞因子分泌減少〔6〕。

Sano等〔7〕對151例食管鱗狀細胞癌分析發(fā)現(xiàn)40.4%的食管鱗狀細胞癌表達CD24，CD表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期、轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)數(shù)目、淋巴管和脈管浸潤正相關，CD24表達與無病生存期相關，多因素分析表明CD24是獨立的預后指標，與本文結(jié)果一致。

EPCAM介導細胞間和細胞內(nèi)的同質(zhì)黏附，具有加快細胞周期、促進細胞增殖、分化、遷移以及免疫逃逸等多種生物學功能。Litvinov等〔8〕將EPCAM cDNA轉(zhuǎn)染入細胞間無黏附功能的鼠成纖維細胞L細胞，細胞形態(tài)發(fā)生了變化，細胞獲得黏附功能并集成細胞串。EPCAM的黏附作用較E-鈣黏蛋白(E-cadherin)松散，且為鈣離子非依賴性，EPCAM對E-cadherin介導的黏附有負性調(diào)節(jié)作用。細胞分化過程中，EPCAM的黏附作用取代了 E-cadherin保持細胞正常狀態(tài)，增殖期過后 EPCAM表達下降，E-cadherin高表達介導細胞黏附引發(fā)細胞的分化。Munz等〔9〕研究顯示，EPCAM過表達可上調(diào)癌基因C-myc和周期素A、E，加快細胞周期，促進細胞增殖。因而設想EPCAM表達的調(diào)節(jié)增強E-鈣黏蛋白等介導的細胞間黏附，從而影響細胞的遷移、侵襲和增殖。最近研究解釋了EPCAM在人腫瘤及腫瘤增殖細胞高水平表達與預后差密切相關，EPCAM本身有致瘤活性，在于其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域EPICD(含有短的26個氨基酸)，通過Wnt-β-catenin信號轉(zhuǎn)導途徑實現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄的〔10〕。此途徑的一些成分參與EPCAM信號轉(zhuǎn)導和基因調(diào)節(jié)，對于正常及惡性干細胞具有顯著意義。

目前EPCAM已用于腫瘤的診斷與治療。Zhang等〔11〕用定量RT-PCR檢測60例胸、腹腔滲出液脫落細胞EPCAM-mRNA，發(fā)現(xiàn)其診斷惡性滲液的敏感性、準確性分別為75.0%和81.6%，均高于細胞學檢查的55.6%和67.3%，因而認為，Ep-CAM-mRNA是鑒別良惡性滲液的敏感指標。在一項開放、多中心的臨床I/Ⅱ臨床實驗中，結(jié)腸癌、胃癌和胰腺癌腹膜轉(zhuǎn)移患者中，應用抗EPCAM單抗可抑制腫瘤進展〔12〕，給EPCAM陽性的上皮源性腫瘤(胃腸道、卵巢、NSCLC等)及惡性腹胸水的免疫導向治療帶來了新的希望。目前，其Ⅱ、Ⅲ期臨床實驗已完成，耐受性良好，副作用少或輕微。

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2 Went PT，Lugli A，Meier S，et al.Frequent EPCAM protein expression in human carcinomas〔J〕.Hum Pathol，2004;35(1):122-8.

3 Du W，Ji H，Cao S，et al.EPCAM:a potential antimetastatic target for gastric cancer〔J〕.Dig Dis Sci，2010;55(8):2165-71.

4 Osta WA，Chen Y，Mikhitarian K，et al.EPCAM is overexpressed in breast cancer and is a potential target for breast cancer gene therapy〔J〕.Cancer Res，2004;64(16):5818-24.

5 Yanamoto S，Kawasaki G，Yoshitomi I，et al.Clinicopathologic significance of EPCAM expression in squamous cell carcinoma of the tongue and its possibility as a potential target for tongue cancer gene therapy〔J〕.Oral Oncol，2007;43(9):869-77.

6 Mitra M，Kandalam M，Harilal A，et al.EpCAM is a putative stem marker in retinoblastoma and an effective target for T-cell-mediated immunotherapy〔J〕.Mol Vis，2012;18:290-308.

7 Sano A，Kato H，Sakurai S，et al.CD24 expression is a novel prognostic factor in esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Ann Surg Oncol，2009;16(2):506-14.

8 Litvinov SV，Velders MP，Bakker HA，et al.EPCAM:a human epithelial antigen is a homophilic cell-cell adhesion molecule〔J〕.J Cell Biol，1994;125(2):437-46.

9 Munz M，Kieu C，Mack B，et al.The carcinoma-associated antigen Ep-CAM upregulates c-myc and induces cell proliferation〔J〕.Oncogene，2004;23(34):5748-58.

10 Jaenisch R，Young R.Stem cells，the molecular circuitry of pluripotency and nuclear reprogramming〔J〕.Cell，2008;132:567-82.

11 Zhang KH，Cao F，F(xiàn)u QB，et al.Detection of mRNAs of GA733 genes byRT-PCR in exfoliated cells of pleural and peritoneal effusions and its clinical values〔J〕.Int Med，2007;46(18):1489-94.

12 Str?hlein MA，Lordick F，Rüttinger D，et al.Immunotherapy of peritoneal carcinomatosis with the antibody catumaxomab in colon，gastric，or pancreatic cancer:an open-label，multicenter，phase I/Ⅱ trial〔J〕.Onkologie，2011;34(3):101-8.