李旭華 陳 月 吳文苑 陳茳晶 金紅濤

(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，深圳市人民醫(yī)院檢驗科，深圳518020)

乙型肝炎疫苗是當(dāng)今預(yù)防乙型肝炎的主要方法，但正常人按標(biāo)準(zhǔn)方案進行一個免疫程序后，仍有5%～10%的抗體滴度不能達到保護性閾值(抗-HBs＜10 U/L)，即無、弱應(yīng)答者，成為 HBV易感者［1］。乙肝疫苗無(弱)應(yīng)答的發(fā)生受多種因素的影響，其確切機制目前仍不十分清楚。近年有研究人員嘗試用黃芪多糖和高分子聚合物作佐劑來提高乙肝疫苗無應(yīng)答者的應(yīng)答率，但效果不一，且副作用未知。甘草酸苷(Glycyrrhizin，GL)為甘草中的主要成分，是一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑，且人體吸收良好。本文通過體外研究GL和HBsAg聯(lián)合應(yīng)用對乙肝疫苗無應(yīng)答者外周血單個核細胞(PBMC)細胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-10)和 共 刺 激 分 子 B7(CD80、CD86)mRNA表達水平的影響，并觀察其刺激誘導(dǎo)的樹突狀細胞(DC)可否促進同種異體淋巴細胞增殖和提高CTL的殺傷活性，探討GL對乙肝疫苗無應(yīng)答者免疫功能的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1．1 研究對象 選擇我院體檢的乙肝疫苗無應(yīng)答者50例為無應(yīng)答組，年齡18～45歲，其中男性27例，女性23例，均為常規(guī)0、1、6三針接種乙肝基因工程疫苗，于第三針接種后一個月檢測乙肝兩對半結(jié)果全陰，而后加強一針后一個月檢測仍為五項全陰者。應(yīng)答組50例為接種乙肝疫苗后HBsAb檢測陽性(＞100 U/L)的健康人群。各組均于接種最后一針疫苗一個月后采血。全部研究對象均排除HAV、HCV和HBV-DNA(+)隱性感染及心腦腎和其他器官疾病。

1．2 主要儀器及試劑 熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，臺式離心機、紫外分光光度計(Eppendorf公司)，電泳儀(瑞士 AMERSHAM公司)，凝膠成像系統(tǒng)、酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)，RNA提取試劑 Trizol(Invitrogen公司)，RT-PCR和 SYBR Green Real-time PCR試劑盒(Takara公司)，淋巴細胞分離液(北京鼎國生物公司)，rhGM-CSF、rhIL-4(Pepro-Tech公司)，CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)，甘草酸苷(日本米諾發(fā)源制藥株式會社)，HBsAg(大連高新生物制藥有限公司)，引物設(shè)計使用Primer5．0，由Invitrogen公司合成(見表1)。

1．3 實驗方法

1．3．1 PBMC的獲取 取研究對象的外周血，肝素抗凝后，與等量的RPMI1640混勻，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離PBMC;臺盼藍染色，證實活細胞達95%以上;用PBS洗去血小板，然后再用含10%人AB血清的RPMI1640懸浮PBMC。

1．3．2 Real-time PCR分析細胞因子和共刺激分子的表達 實驗分組:(1)應(yīng)答組:乙肝疫苗應(yīng)答者PBMC+HBsAg;(2)GL+HBsAg+無應(yīng)答組:乙肝疫苗無應(yīng)答者PBMC+HBsAg+GL;(3)HBsAg+無應(yīng)答組:乙肝疫苗無應(yīng)答者PBMC+HBsAg;(4)GL+無應(yīng)答組:乙肝疫苗無應(yīng)答者PBMC+GL。前三組均給予5 μg/ml終濃度的 HBsAg刺激，GL+HBsAg刺激組同時給予終濃度10 μg/ml的GL刺激，第四組只給予終濃度10 μg/ml的GL刺激，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時后收集細胞至1.5 ml的 EP管中。每管分別加入1 ml Trizol，氯仿/異丙醇法提取總RNA，紫外分光光度計測定提取的RNA濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，并對逆轉(zhuǎn)錄的cDNA在ABI7500實時熒光定量基因擴增儀上進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)總體系25 μl。Real-time PCR擴增條件為95℃30秒預(yù)變性，95℃變性5秒，60℃退火和延伸34秒，40個循環(huán)。每個樣品3個重復(fù)，同時設(shè)無模板對照。將IFN-γ、IL-4、IL-10、CD80 和 CD86 的 mRNA 與 GAPDH的(Ct值)換算為基因的相對表達量2-△△Ct，將正常對照組歸一化處理，比較各組間的表達差異。

1．3．3 DC的誘導(dǎo) 取研究對象的PBMC(濃度為2 ×106ml－1)，加入6 孔板(2 ml/孔)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中溫育2小時后分別收集貼壁細胞和懸浮細胞。實驗組分為乙肝疫苗應(yīng)答組和無應(yīng)答組。應(yīng)答組:加入 rhGM-CSF 100 μg/L 和 rhIL-4 100 μg/L 刺激，于第5天加入HBsAg(5 μg/ml);無應(yīng)答組分為2組，組1為常規(guī)誘導(dǎo)組:加入rhGM-CSF 100 μg/L和rhIL-4 100 μg/L培養(yǎng)8天;組2再分①、②、③三組:每組均加入 rhGM-CSF 100 μg/L和 rhIL-4 100 μg/L，培養(yǎng)第5天再按分組加入不同刺激物，①組:HBsAg(5 μg/ml);②組:HBsAg(5 μg/ml)+GL(10μg/ml);③組:GL(10 μg/ml)。隔天半量換液并補充細胞因子，倒置顯微鏡觀察細胞生長數(shù)量及形態(tài)變化，第8天可見細胞呈懸浮狀態(tài)，體積增大，偽足樣、樹枝狀突起增多、變長。

表1 實時定量PCR引物序列Tab．1 Primers used to perform Real-time PCR

1．3．4 同種異體混合淋巴細胞反應(yīng) 取乙肝疫苗應(yīng)答者的 PBMC，37℃、5%CO2培養(yǎng)2小時后收集非貼壁的淋巴細胞，調(diào)整濃度為1×106ml－1作效應(yīng)細胞。取1．3．3中各組誘導(dǎo)的 DC，加入 25 μg/ml絲裂霉素C去除增殖作用并調(diào)整密度為1×105ml－1作刺激細胞，依據(jù)預(yù)實驗確定1∶20為DC與異體淋巴細胞最適比例，對照孔不加DC，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育72小時，加入 CCK-8溶液10 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，測OD450值，結(jié)果以3孔均值表示。刺激指數(shù)(SI)=實驗孔OD450/對照組OD450。

1．3．5 細胞殺傷活性測定 取1．3．3中誘導(dǎo)的各組DC分別加自體淋巴細胞混合培養(yǎng)7天誘導(dǎo)出CTL作為效應(yīng)細胞，同時設(shè)對照組為單純自體淋巴細胞。取傳代后24小時的K562細胞作為靶細胞，調(diào)整濃度為5×104ml－1。效應(yīng)細胞濃度分別調(diào)整為2．5 × 105、5 × 105、1 × 106ml－1，效靶比依次為5∶1、10∶1、20∶1。置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育 48小時，加入 CCK-8溶液10 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，測OD450nm值，結(jié)果以3孔均值表示。

細胞殺傷率(%)=(單純效應(yīng)細胞孔的OD450值+單純靶細胞孔的OD450值－細胞毒實驗孔的OD450值)/單純靶細胞孔的OD450值×100%。

1．4 統(tǒng)計學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)采用SPSS18．0軟件進行統(tǒng)計，計量資料以±s表示，多組間統(tǒng)計分析采用F分析和多因素的方差分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 GL對乙肝疫苗無應(yīng)答者PBMC細胞因子mRNA表達的影響 如圖1所示，HBsAg+GL+無應(yīng)答組PBMC的IFN-γ、IL-4 mRNA表達水平低于應(yīng)答組(P＜0．05)，IL-10 mRNA表達無明顯差異(P＞0．05);但與HBsAg+無應(yīng)答組比較，HBsAg+GL+無應(yīng)答組和GL+無應(yīng)答組PBMC的IFN-γ、IL-10 mRNA表達水平均明顯提高(P＜0．05)，且后者低于前者(P＜0．05);而IL-4 mRNA變化在無應(yīng)答者的三組間無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。

2．2 GL對乙肝疫苗無應(yīng)答者PBMC共刺激分子mRNA表達的影響 如圖2所示，HBsAg+GL+無應(yīng)答組PBMC的CD80和CD86 mRNA表達水平都顯著高于HBsAg+無應(yīng)答組和GL+無應(yīng)答組(P＜0．05)，但CD80 mRNA與應(yīng)答組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)，而CD86 mRNA強于應(yīng)答組;此外，GL+無應(yīng)答組CD80、CD86 mRNA的表達水平皆高于HBsAg+無應(yīng)答組(P＜0．05)。

2．3 GL對乙肝疫苗無應(yīng)答者同種異體淋巴細胞增殖反應(yīng)的影響 如圖3所示，各實驗組DC都能有效地刺激同種異體淋巴細胞增殖，其中實驗組②的DC刺激淋巴細胞增殖的作用明顯高于其他各組(P＜0．05);另外，實驗組③的DC對淋巴細胞增殖的刺激作用強于實驗組①(P＜0．05)，但低于應(yīng)答組(P＜0．05);實驗組 ①與常規(guī)誘導(dǎo)組比較無顯著差異(P ＞0．05)。

圖1 不同組 PBMC的IFN-γ、IL-4、IL-10 mRNA 表達的相對量(n=3)Fig．1 The expression of IFN-γ，IL-4，IL-10 mRNA in PBMC of different groups(n=3)

圖2 不同組PBMC的CD80、CD86 mRNA表達的相對量(n=3)Fig．2 The expression of CD80，CD86 mRNA in PBMC of different groups(n=3)

2．4 GL對乙肝疫苗無應(yīng)答者CTL殺傷活性的影響 見表2，與對照組比較，各實驗組CTL對K562細胞的殺傷活性均有提高，其中實驗組②的CTL殺傷活性明顯高于實驗組①和③(P＜0．05)，且隨著效靶比升高而增強，與應(yīng)答組比較無明顯差異(P＞0．05);此外，實驗組③的CTL殺傷活性高于實驗組①(P ＜0．05)。

圖3 不同實驗組DC刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力(n=3)Fig．3 the proliferation of allogenetic T cell with different experimental groups(n=3)

表2 不同實驗組CTL對K562細胞殺傷率(%，x ± s，n=3)Tab．2 Killing effects on K562 cell with different experimental groups(%，x ± s，n=3)

3 討論

GL是一種良好的免疫調(diào)節(jié)劑。有學(xué)者嘗試?yán)闷涿庖哒{(diào)節(jié)功能治療潰瘍性結(jié)腸炎、斑禿等免疫失衡引起的疾病，均取得了良好的效果［2，3］。現(xiàn)已證實GL治療慢性乙型肝炎具有一定的優(yōu)勢且療效確定，認為可打破機體免疫耐受或低下狀態(tài)，影響抗-HBs出現(xiàn)的時間和滴度，甚至有學(xué)者嘗試用于SARS和H5N1型禽流感的治療以及抗腫瘤藥物的保護劑，均取得了顯著的療效［4，5］。但其與乙肝疫苗無(弱)應(yīng)答的關(guān)系方面鮮有報道。因此，本文研究觀察了GL與乙肝疫苗聯(lián)合應(yīng)用可否誘導(dǎo)機體選擇性地增強和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，從而有效地提高機體對乙肝疫苗的應(yīng)答能力。

近年研究發(fā)現(xiàn)，GL并非單純地影響某一種或幾種細胞因子的升高或降低，而是可以打破機體Th1和Th2類細胞因子的失衡狀態(tài)，對于機體免疫功能失調(diào)的修正意義重大［6］。乙肝疫苗無(弱)應(yīng)答機制主要與機體免疫功能不完善有關(guān)，無(弱)應(yīng)答者體內(nèi)Th1/Th2細胞因子分泌水平變化而導(dǎo)致的機體免疫狀態(tài)失衡是保護性抗體不能產(chǎn)生的重要因素［7］。本文研究結(jié)果顯示，HBsAg+GL聯(lián)合刺激可顯著提高無應(yīng)答者IFN-γ、IL-10 mRNA表達水平，尤其是IL-10 mRNA可達到應(yīng)答組水平。已證實IFN-γ是典型的Th1細胞因子，對被稱為T細胞分化因子的IL-2具有促進作用，其缺乏意味著機體對抗原特異性的無能。IL-10最初認為是一種Th2細胞因子，然而新近研究發(fā)現(xiàn)［8］，Th1細胞在IL-12的輔助下亦可分泌IL-10，其增加在維持Th1/Th2細胞因子平衡中發(fā)揮了重要的作用，提高機體的體液免疫水平，還可以抑制IL-4產(chǎn)生，提示GL可通過調(diào)節(jié)細胞因子影響機體的免疫應(yīng)答過程，對于機體產(chǎn)生達到保護作用的抗體具有積極的促進作用。IL-4主要由Th2細胞產(chǎn)生，抑制Th1細胞增殖及其應(yīng)答。在本研究中，IL-4的表達并未有明顯變化，推測與GL對Th1類細胞因子影響作用更大有關(guān)。

機體對疫苗應(yīng)答產(chǎn)生足量的保護性抗體，是一個復(fù)雜的免疫反應(yīng)過程。目前，國內(nèi)外推廣使用的乙肝表面抗原疫苗是嚴(yán)格的胸腺依賴抗原，易誘導(dǎo)免疫耐受。研究認為，共刺激分子 B7(CD80、CD86)及其配體CD28結(jié)合是特異性免疫應(yīng)答發(fā)生的重要因素，在防止形成免疫耐受方面起關(guān)健作用，其表達不足會直接影響乙肝疫苗誘導(dǎo)抗-HBs形成［9］。本文研究結(jié)果顯示，與HBsAg單獨刺激組比較，HBsAg+GL聯(lián)合刺激組CD80、CD86 mRNA表達水平明顯提高，尤其是CD86 mRNA表達水平甚至超過應(yīng)答組水平，說明GL對于機體產(chǎn)生足夠強度的免疫應(yīng)答具有積極地促進作用。

DC是唯一能夠刺激初始T細胞活化的APC，成熟DC具有豐富共刺激信號及其他黏附分子表達，同時分泌多種細胞因子，有利于激活其他免疫細胞，誘導(dǎo)出高效的免疫效應(yīng)。Overton［10］證實:接種時加入GM-CSF佐劑并不能有效提高抗體滴度。Akbar等［11］利用HBsAg刺激強應(yīng)答者DC后輸入無應(yīng)答者體內(nèi)雖然產(chǎn)生一定的效果，但不甚理想，且異體DC的免疫原性問題有待解決。Hua等［12］新近報道，純化的GL可誘導(dǎo)鼠DC表型和功能成熟，增強CD86、CD40、CD80、CD83 和 MHC II表達，并促進IL-12、IL-10分泌而降低TNF-α產(chǎn)生。本文研究結(jié)果顯示，GL+HBsAg聯(lián)合刺激組DC促進同種異體淋巴細胞增殖的效應(yīng)顯著，且強于應(yīng)答組，提示GL可促進DC成熟從而增強乙肝疫苗無應(yīng)答者免疫功能。此外，研究還發(fā)現(xiàn)在HBV隱匿性感染兒童(乙肝DNA定量仍為陰性)中，大部分接種乙肝疫苗后產(chǎn)生的抗體滴度都不能達到保護水平，認為隱匿性感染導(dǎo)致的免疫耐受是乙肝疫苗無應(yīng)答的主要原因［13］。本文結(jié)果顯示，GL+HBsAg聯(lián)合刺激組CTL的細胞殺傷活性顯著提高，與應(yīng)答組比較無明顯差異，且殺傷作用隨效靶比的升高而增強，也表明GL這種佐劑作用具有潛在的治療價值。同時由于CTL活性增強，分泌IFN-γ，激活巨噬細胞及誘導(dǎo)病毒感染細胞表達MHC分子等能力都大大增強，使得低通量病毒感染引起的對乙肝疫苗免疫耐受的這一漏洞有望改善。

根據(jù)免疫學(xué)的研究結(jié)果，如何提高機體對乙肝疫苗的應(yīng)答能力是一個重要而長期的研究課題。我們的研究結(jié)果表明，GL可使機體的免疫狀態(tài)向Th1方向漂移，能促進DC成熟，使得乙肝疫苗無(弱)應(yīng)答者抗原提呈這一薄弱環(huán)節(jié)得到加強，從而打破其體內(nèi)的免疫異常狀態(tài)。因此，雖然體內(nèi)效應(yīng)有待進一步研究，GL仍有望成為一種潛在的有前途的疫苗佐劑用于提高乙肝疫苗接種人群的應(yīng)答率。

1 Coates T，Wilson R，Patrick G et al．Hepatitis B vaccines:assessment of the seroprotective efficacy of two recombinant DNA vaccines［J］．Clin Ther，2001;23(3):392-403．

2 Kudo T，Okamura S，Zhang Y et al．Topical application of glycyrrhizin preparation ameliorates experimentally induced colitis in rats［J］．World J Gastroenterol，2011;17(17):2223-2228．

3 陸富永，明海霞，劉 懿et al．復(fù)方甘草酸苷聯(lián)合光化學(xué)療法治療斑禿30例療效觀察［J］．中國皮膚性病學(xué)雜志，2011;25(2):163-164．

4 Michaelis M，Geiler J，Naczk P et al．Glycyrrhizin inhibits highly pathogenic H5N1 influenza A virus-induced pro-inflammatory cytokine and chemokine expression in human macrophages［J］．Med Microbiol Immunol，2010;199(4):291-297．

5 Arjumand W，Sultana S．Glycyrrhizic acid:A phytochemical with a protective role against cisplatin-induced genotoxicity and nephrotoxicity［J］．Life Sci，2011;89(13-14):422-429．

6 陳觀尚．復(fù)方甘草酸苷治療慢性乙型肝炎的療效觀察及對IL-8和IL-10的影響［J］．廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010;28(2):143-144．

7 Goncalves L，Albarran B，Salmen S et al．The nonresponse to hepatitis B vaccination is associated with impaired lymphocyte activation［J］．Virology，2004;326(1):20-28．

8 Kemp K L，Levin S D，Stein P L．Lck regulates IL-10 expression in memory-like Th1 cells［J］．Eur J Immunol，2010;40(11):3210-3219．

9 黃 茵，陳 智，徐承槐 et al．乙肝疫苗無、弱應(yīng)答與B7-CD28及IL-12、IL-10的相關(guān)性［J］．免疫學(xué)雜志，2002;6(11):452-455．

10 Overton E T，Kang M，Peters M G et al．Immune response to hepatitis B vaccine in HIV-infected subjects using granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF)as a vaccine adjuvant:ACTG study 5220［J］．Vaccine，2010;28(34):5597-5604．

11 Fazle Akbar S M，F(xiàn)urukawa S，Yoshida O et al．Inductionof anti-HBs in HB vaccine nonresponders in vivo by hepatitis B surface antigen-pulsed blood dendritic cells［J］．J Hepatol，2007;47(1):60-66．

12 Hua H，Liang Z，Li W et al．Phenotypic and functional maturation of murine dendritic cells(DCs)induced by purified Glycyrrhizin(GL)［J］．Int Immunopharmacol，2012;12(3):518-525．

13 Mu S C，Lin Y M，Jow G M et al．Occult hepatitis B virus infection in hepatitis B vaccinated children in Taiwan［J］．J Hepatol，2009;50(2):264-272．